제시된 것은 미생물과 외종의 효과적인 농축 및 격리를 위한 종이 기반 장치를 제조하는 프로토콜이다.
Microvesicles 및 엑소좀은 세포 외 환경에 풀어 놓이고 바디를 통해 순환하는 작은 membranous 소포입니다. DNA, mRNA, miRNA, 단백질 및 지질과 같은 다양한 부모 세포 유래 생체 분자를 함유하고 있기 때문에, 그들의 농축 및 격리는 임상 응용을 위한 잠재적인 바이오마커로서 그들의 착취를 위한 중요한 단계입니다. 그러나, 종래의 절연 방법(예를 들어, 초원심분리)은 마이크로베실 및 엑소좀에 상당한 손실과 손상을 일으킨다. 또한 이러한 방법은 시약의 초원심 분리, 적재 및 낭비의 여러 반복 단계가 필요합니다. 이 문서에서는 간단한 방식으로 미세 채소와 외종의 효과적인 농축 및 절연을 위해 설계된 종이 접기 종이 기반 장치 (엑소-PAD)를 제조하는 상세한 방법을 설명합니다. 수렴 시료 영역이 있는 아코디언형 다층으로 구성된 엑소-PAD의 독특한 디자인은 이온 농도 편광 기술과 통합되어 특정 층에서 마이크로베실과 외종의 5배 농축을 가능하게 한다. 또한, 농축된 마이크로베실과 엑소솜은 엑소-PAD를 펼치기만 하면 격리된다.
마이크로베식과 엑소좀은 각각 0.2-1 μm 및 30-200 nm를 측정하는 작은 멤브레인 소포입니다. 그(것)들은 몇몇 다른 세포,모형1,,2,3,,4,5에의해 세포 외 환경으로 분비됩니다., 그들은 DNA, mRNA, miRNA, 단백질 및 지질의 하위 집합의 형태로 부모 세포 정보를 포함하고, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 양수 및 타액6,,7,,8,,9와같은 다양한 체액을 통해 신체 전체를 순환한다. 따라서, 생물학적 유체로부터 미생물과 외종의 효율적인 분리를 위한 기술은 새로운 치료법의 개발뿐만 아니라 질병의 진단, 예후 및 실시간 모니터링 분야에서 광범위한 기회를 제공할 수 있다.
그러나, 초원심분리에 기초한 마이크로베실 및 엑소좀에 대한 종래의 절연 방법은 매우 시간이 많이 소요되고 시료의 상당한 손실 및 오염을 야기한다. 이는 여러 번거로운 파이펫팅 및 적재 단계와 반복된 초원심,분리5,6,,10,11,,12를포함하는 다양한 시약의 폐기를 수반하기 때문이다., 더욱이, 초원심심분리(~100,000 x g)에의해 유도되는 높은 전단 응력은 미생물과 외종의 물리적 용해를 유발하여 회복율(5-23%)6,,13,,14를산출할 수 있다. 따라서, 마이크로베식및 엑소좀을 위한 매우 효율적이고 눈에 거슬리지 않는 격리 기술은 손상과 손실을 줄이기 위해 개발되어야 하므로 더 높은 회수율을 달성해야 합니다.
종이 접기 종이 기반 장치 (엑소-PAD)는 마이크로베실과 엑소좀6의간단하고 온화하며 매우 효율적인 격리를 위해 개발되었습니다. 엑소-PAD의 디자인은 지름이 점차 감소하는 일련 적으로 연결된 샘플 영역이 있는 다중 접힌 종이입니다. 이온 농도 편광(ICP) 기술은 전농축이 전하된 생체분자를 전하하는 나노 전기키네틱 현상이며, 이 독특한 설계와 통합되었다. Exo-PAD를 사용하면 특정 층에서 마이크로베식과 엑소좀이 5배 농축되고 장치를 전개하기만 하면 격리가 발생했습니다. 이 문서에서는 엑소-PAD를 자세히 설명하며, 전체 장치 제조 및 작동에서 사용 분석에 이르기까지 방법을 설명하고 대표적인 결과를 보여주는 6을설명한다.
엑소-PAD는 마이크로베실과 외종의 농축 및 절연을 위해 성공적으로 사용되었지만, 여러 가지 중요한 점은 신중하게 고려해야 합니다: 1) 장치 제조 중 오븐 잠복기 시간과 온도, 2) 처리 시간, 3) 다양한 층 수와 샘플 영역 직경을 가진 전압의 적용, 그리고 4) 임상 샘플에 대한 적용가능성.
프로토콜에 주어진 인큐베이션 시간과 온도는 신뢰할 수 있는 장치를 조작하는 데 최적화…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 한국 국립연구재단인 그랜트 NRF-2018R1D1A09090840444가 지원했다. 이준은 2019년 광운대학교 연구보조금의 지원을 받았다. 김효린 은 한국과학기술원(KIAT)이 운영하는 산업통상자원부(MOTIE)의 ‘산업전문가를 위한 역량개발 프로그램’의 지원을 받았다. P0002397, 웨어러블 스마트 기기의 산업 융합을 위한 HRD 프로그램).
Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |