ラット心臓から消化バッファーにおける連続組織消化、再発遠心サイクルからの細胞採取、抗ラットCD31マイクロビーズによる細胞浄化を通じて、内心細胞と冠状動脈内皮細胞を単離するためのプロトコルを提示する。
心内皮細胞(EIc)と冠状動脈内皮細胞(CECs)の起源、発達、マーカー、機能が異なったことが示されています。その結果、これら2つの細胞集団は、心臓病においてユニークな役割を果たす。孤立した内皮細胞を含む現在の研究は、EICとCECの両方からなる細胞集団を調査する。このプロトコルは、細胞固有の特性評価のためにこれら2つの細胞集団を独立して分離する方法を概説する。左右の心室自由壁の集まりに続いて、外面および内面からの内皮細胞は消化緩衝液を用いて別々に遊離される。外表面と内心内膜層の順次消化は、2つの内皮細胞集団の分離を保持した。EECsとCECの分離は、各集団に固有のマーカーの同定によってさらに検証されます。マウス心臓での以前に公開された単一細胞RNAプロファイリングに基づいて、Npr3 、Hapln1、およびCdh11遺伝子発現はEICに固有である。一方、Fabp4 、Mgll、およびCd36遺伝子発現は、CECs に固有です。qPCRデータは、これらの特性マーカーの濃縮発現をそれぞれのサンプルで明らかにし、EECおよびCECの分離の成功を示し、細胞表現型の維持と同様に、さらなる細胞特異的機能解析を可能にした。
本稿では、ラット心臓からの内膜内皮細胞(EIC)および冠状動脈内皮細胞(CCs)の解剖およびその後の分離のための詳細なプロトコル(Gladkaらら1から改変)を提供する。これらの細胞集団を独立して調査する能力は、潜在的な治療標的として役立つ様々な心臓病の基礎となる細胞型特異的メカニズムの探索を可能にするであろう。しかし、これらの細胞集団のコレクションを独立して収集する方法はまだ公表されていません。
セックは、その起源、マーカー、および心臓の発達と,,,疾患11、2、3、4、5、6、72,3の間の機能に関してEICとは異なります。6,745EICは心臓中転体3の腹側表面に由来する。それらは、VEGFおよびHIFシグナル伝達に応答してFlk1+前駆細胞から生じ、発達中の心臓の3つの離散領域の最も内側の層を形成する:心房、心室、および静脈内の33、6。6+遺伝的系統トレースは、静脈内静脈の多能性心筋細胞が静脈細胞を導き出すことを示唆しており、これは、下epicardial層3を形成するために移行する。その後、亜エピカルジアル層は、末梢室自由壁33、44を横切って残るCEを含む冠状動脈および静脈に分化する。この内皮経路への心内膜は、VEGFC、ELA/APJ、およびSOX17シグナル伝達3、4、6、8、94,6,8,9によって調節される。心室心内膜は、未知のメカニズム3によって心室中隔のより少ないセクチを導き出す。続いて、EECsとCECの局所的な分化は、これらの2つの細胞集団に特有のマーカーによって示唆される、 IcのMgll、Fabp4、Cd36発現、またはNpr3、Cdh11、およびHapln1発現を含むEIc Mgll Cd36 Fabp4, 3,3、5、10,10の。
EECsとCECは、心機能において異なる役割を果たします。心筋間葉転移、弁形成、チャンバー成熟、流出路調節、および房室管の発達はEIc6に依存している。あるいは、CECsは冠状動脈11の血管運動の緊張および炎症に寄与する。これらの機能の差異は、疾患の発症における個別の役割を生じ4,12.例えば、EICの機能不全は先天性弁疾患6、非圧縮心筋6、房室性隔壁効果6、子宮内膜線維芽症13、低形成左心症候群13、心室形成不全13、および心臓肥大症12を引き起こす可能性があることを示唆している。同様に、研究は異常なCEが冠状動脈疾患14および血栓症11に寄与することを発見した。
これらの2つの細胞集団の包括的な知識を達成するには、EECsとCECの分離が成功する必要があり、研究と臨床の両方の場面で活用できます。これらの細胞集団の増殖および分化因子を決定することは、誘導多能性幹細胞(iPSC)からの内皮サブタイプの分化のための基準となるであろう。さらに、EIcやCECの開発、調節、機能の差異を完全に同定することは、細胞型特異的な方法で多数の心臓病を引き起こすゲノムおよびエピゲノム因子を理解するために不可欠である。この記事では、EECsとCECsを個別に収集するためのステップを個別に概説し、細胞型特異的マーカーの遺伝子発現レベルを評価することによって分離の証拠を提供します。
CECとEECsは、起源、マーカー、機能が異なるため、開発や病気において独自の役割を果たす可能性があります。内皮細胞分離のための既存のプロトコルは、大血管組織に限定され、EECの収集を無視し、CECおよびEEC固有の機能の研究を制限する。この知識は、将来の研究のために、ICおよびEICへのiPSCの分化のための参照を提供し、様々な心臓病の潜在的な治療目標のためにこれらの細胞集団の検査を容易にするので、これら2つの集団を独立して分離し、研究することが不可欠である。この新しいプロトコルは、成人ラットの心室のない壁の外表面からEICを内面およびCECから分離する方法を概説する。
このプロトコルでは、各ステップのタイミングを非常に正確に制御することが重要です。EECsの数はラットの心臓組織では非常に限られているため、細胞の損傷を防ぐために心臓の内層の消化時間を最小限に抑え、さらに重要なことに、CEC汚染を防ぎます。酵素反応を終了させるEC培地溶液の即時添加は、高い細胞生存率を維持するためにも非常に重要である。赤いペレットは、RBCsの多数の存在を示唆しています.RBC汚染の量に応じて、RBCの溶菌バッファーの1〜2 mLを添加してRBCsを劣化させることができます。現在のプロトコルを使用して、6つのラットの心臓から105 EICを分離することができました。これらの細胞は、さらなる拡張および特性評価のために細胞培養皿に播種することができる。
自由な壁のコレクションのために組織を準備するとき、心臓はHBSSで洗浄して残りのRBCsの大部分を除去する。HBSSは、フェノールレッドを含むDMEDとは対照的に、血液細胞の可視化を可能にする明確な外観のために推奨される媒体である。消化バッファーの組成は、内皮細胞の十分な解放を保証します, リベラ消化酵素が露出した細胞の組織を取り除くところ、DNase Iは死細胞からDNAを排除してDNAの接着品質によって阻害される細胞剥離を促進し、HEPESバッファーはpHのバランスをとり、DMEMはより良い細胞維持のためにアミノ酸およびビタミンの濃度が高い修飾基底培地であり、リベラーゼを活性化するために必要なカルシウムを含む。
ヒト15およびマウス心臓10の両方から得られた単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)によれば、特定のEC集団に起因するいくつかのマーカーが報告された。我々は、最も富化された遺伝子のいくつかを選択して、単離されたEECs(すなわち、Npr3、Cdh11、およびHapln1)およびEIC(すなわち、Mgll、Fabp4、およびCd36)の純度を調べた。 Cdh11 Fabp4β-アクチン、Npr3、Cdh11、およびHapln1マーカーに対して、CECsと比較してEICの発現が増加した。 Cdh11同様に、CICでは、EICと比較してMgll、Fabp4、およびCd36マーカーの発現が大きかった。 Fabp4各サンプルの一意に表現されたマーカーは、EIC と CEC に特有のマーカーとそれぞれ一致しており、分離が成功したことを示しています。
しかし、現在のプロトコルは、慎重に制御された逐次消化を伴う場合でも、分離中の2つのEC集団間の交差汚染を排除することはできません。したがって、いくつかの細胞表面マーカーは、さらなる精製のために適用することができる。例えば、NPR3は一般的に心内膜10にラベルを付け、APJはCEC16の大部分をトレースすることができます。これら2つのマーカーは細胞表面に発現するため、蛍光活性化細胞選別(FACS)や、さらに異なるEC集団を精製するために使用される抗体に使用することができます。さらに、ヒト15およびマウス10の心臓scRNA-seqはEICにおけるNpr3の濃縮を確認することができ、Cd36はCEC精製に潜在的に使用することができる。
結論として、提示されたプロトコルは、ラット心臓からのEICとCECの独立した分離を概説する。細胞分離によって可能になる細胞特性の包括的な識別は、重要な下流アプリケーションに利用することができる。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、リンリ・ワン博士が動物プロトコルを支援し、スタンフォード小児科がインフラ支援を行ったことを非常に高く評価している。この作品は、NIH/NHLBI K99 HL135258(M.G.へ)によってサポートされました。
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | 1M |
15ml Tubes | Eppendorf | 0030122151 | |
50ml Tubes | Nunc | 339652 | |
5ml Tubes | Eppendorf | 30119401 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
Anti-CD31 PE | Miltenyi Biotec | 130-115-505 | |
Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 10% |
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 1855485 | For qPCR |
DNAse I | Worthington | LK 003172 | 1 mg/mL in water |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10313021 | |
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | EC Medium |
Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1 | Gibco | 14025092 | |
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-rad | HSP3805 | For qPCR |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
Liberase TM | Sigma Aldrich | 5401119001 | 5 mg/mL |
MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | For EC isolation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | For EC isolation |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-rad | MSB1001 | For qPCR |
Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | For heart harvest |
Nylon Sterile Strainer | Falcon | 352340 | 40 mm |
Phosphate Buffered Saline (PBS) X1 | Gibco | 1001023 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | For qPCR |
Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1050 | For RNA extraction |
S&T Forceps – SuperGrip Tips | F.S.T | 00632-11 | For heart harvest |
Strabismus Scissors – Tungsten Carbide | F.S.T | 14574-11 | For heart harvest |
Vannas Spring Scissors – Microserrated | F.S.T | 15007-08 | For heart harvest |