从鼠心心室自由壁分离内膜细胞和冠状内皮细胞

所有动物程序都得到斯坦福大学实验室动物护理行政小组（APLAC31608）的批准。 1. 准备缓冲区 使用表 1中列出的试剂准备消化缓冲液。 准备 DNase I 库存解决方案：将 DNase I 溶解在无 Nase 水中，用于 2，000 个单位/mL（1 mg/mL）的库存溶液。在 -20°C 下储存库存溶液。 准备脱脂溶液：用无RNase水溶解脱脂酶，用于5mg/mL的库存溶液。在 4 °C 下将其旋转在滚子堆上 30 分钟。 通过稀释0.50米乙酰二甲二甲酸 （EDTA） 和 10% 牛血清白蛋白 （BSA） 库存溶液，使用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 制备分拣缓冲液，最终浓度为 EDTA 的 2 mM 和 BSA 的 0.5%。 2. 心脏收藏 注：本协议使用了六只重达50~100克的斯普拉格道利大鼠。未观察到性别差异。 用CO2对大鼠进行安乐死，并将其置于解剖平台上的上接位置。将四肢固定下来，用70%乙醇对腹部和胸部进行消毒。 用剪刀打开腹部，将21 G针插入位于肠后静脉的后部分。将注射器柱塞拉回来，从静脉中取出血液，直到肝脏颜色变浅，不能再抽血，表明有足够的血液去除。 使用剪刀，小心打开胸部，以避免损害肺部和心脏。用钳子抬起主动脉/中庭，切主动脉、肺动脉、肺静脉和静脉，以释放和取出心脏。 用50 mL的冷1x汉克斯平衡盐溶液（HBSS）缓冲液3倍来洗净心脏，去除过多的血液。 在微切显微镜下，将右心室自由壁取出至含有Dulbecco改性鹰介质（DMEM）（图1A、B）的5mL管中B。 把心放在它更平坦的后脸上，以识别左右两侧。 找到肺动脉，最前部的静脉和动脉从心脏顶部分支，穿过肺动脉，向下切入右心室。在心脏的前脸，沿着隔膜切割，直到到达顶点。继续沿着隔膜从心脏后侧向上切割，直到肺动脉和右心室结点（图1A）。 从肺动脉和右心室结点开始，垂直地将心脏的前侧和后侧垂直地切合到以前的解剖，远离隔膜，直到右心室自由壁从心脏的其余部分中解放出来（图1B）。 在微切显微镜下，将左心室自由壁取出为含有DMEM的5mL管（图1C，D）。D 找到主动脉，从肺动脉后面的心脏顶部分支，重复步骤2.5中描述的方法，切断左心室自由壁。 3. EEC 消化 将左右心室自由壁组织放在60厘米培养皿中，内表面平躺，朝下放置（图2）。注：内表面是微凹形心室的内面，如图2A所示，C所示。 将0.5~1 mL的消化缓冲液加入到盘中，将移液器的尖端直接放在组织下方。继续，直到只有内部表面浸没。 在5%CO 2，37°C孵化器中孵育该菜5分钟。2 将 EC 介质添加到培养盘中以停止消化。注：将消化缓冲液量保持在EC介质的1：5比率。 使用 1 mL 移液器用 EC 介质冲洗心室的内表面，并通过 40 mm 滤网将径流转移到 50 mL 收集管中（图 2E）。将藏品保存在冰上，以便下游净化。 4. CEC消化 沿着左心室的外表面切开，不受内层污染（图2B，D），并分别放入D一个单独的5 mL管中，含有1 mL的消化缓冲液。注：左心室可确定为较厚的心室，外表面可确定为轻微凹裂室的外表面。 使用解剖剪刀，将心室壁切成小，1毫米3件。 将管子孵育在37°C的水浴中约15~20分钟。涡旋每2~3分钟。 移液器 4 mL EC 介质进入 5 mL 管，以终止消化。 通过40mm滤网将溶液与5 mL血清移液器转移到50 mL管中（图2E）。将藏品保存在冰上，以便下游净化。 5. 细胞集合 在室温 （RT） 下，将管子在 300 x g下离心 10 分钟，然后吸气上清液。 如果颗粒呈红色，则重新悬浮 1×2 mL 的 1x 红血球 （RBC） 裂液缓冲液（图 2F）。注：如果没有 RBC，请继续执行步骤 6。 在37°C水浴中孵育管5分钟。 将 10 mL 的 PBS 移液器放入 50 mL 管中，以停止水烟。 在 RT 时将管子在 300 x g下离心 10 分钟，然后吸气上清剂。 6. EC 排序 在50 mL管中加入90μL的分拣缓冲液和10μL的抗CD31 PE抗体。 旋涡管，然后在4°C的冰箱中孵育10分钟。 将10 mL的分拣缓冲液加入管中，彻底混合，然后在RT时以300 x g的离心机10分钟。 在80μL的分拣缓冲液和20μL的抗PE微珠中吸气上清液并重新悬浮颗粒。 涡旋管，在4°C孵育15分钟。 通过在管中加入10 mL的分拣缓冲液来清洗细胞，彻底混合，然后在RT时以300 x g离心10分钟。 吸气上清液，并在500μL的分拣缓冲液中重新悬浮颗粒。 将含有超顺磁球的柱放入磁性分离器中，然后用3 mL分拣缓冲液冲洗该柱。 柱”流停止”后，移液器 500 μL 的细胞悬浮液进入柱中，然后用分拣缓冲器清洗列。重复洗涤3倍，每个与3 mL的排序缓冲器（图2G）。 从分离器中取出柱子，并将其放在新的 15 mL 收集管顶部。 使用移液器，将 5 mL EC 介质添加到柱位中，并使用柱塞推动解决方案。 在 RT 时将收集管在 300 x g下离心 10 分钟，然后吸气上清液。 按照制造商的说明，使用试剂盒从EEC和CEC样品的细胞颗粒中提取RNA。可以获得至少500纳克的RNA。注：RNA提取后，样品可储存在-80°C。 根据制造商的说明，反向转录 500 ng 的 RNA，使用随机底漆和试剂盒获取 cDNA。 执行定量PCR，以验证内皮和内皮种群（图2H）。引素序列列在表2中。 将 5 μL 的 EEC 或 CEC cDNA （1 纳克/μL） 添加到 384 qPCR 板的孔中。将 EEC 或 CEC cDNA 添加到足够的井中，以便每个底漆数有三口井。 将 6 μL 的 2x qPCR SYBR 绿色缓冲液与每 10 μM 底漆的 0.5 μL 混合，包括正向和反向引底器，并将其添加到与每个候选基因对应的单个井中。 在 RT 时用塑料薄膜和离心机密封板 1 分钟，在 300 x g下。 将板放入 qPCR 机器中，然后在 95 °C 下启动程序 3 分钟，然后以 95 °C 启动 15 秒，然后 55 °C 为 60 秒。