生成基于人类 iPSC 的血脑屏障芯片
Summary
血脑屏障（BBB）是一种多细胞神经血管单元，严密调节大脑平衡。通过结合人类 iPSC 和芯片上器官技术，我们生成了个性化的 BBB 芯片，适用于疾病建模和 CNS 药物渗透性预测。介绍了BBB芯片的生成和运行的详细方案。
Abstract
血脑屏障 （BBB） 由神经血管单元 （NUS） 形成，这些单元保护中枢神经系统 （CNS） 免受血液中发现的一系列可能破坏大脑功能的因素的影响。因此，BBB是向国家癌症系统提供治疗药物的主要障碍。积累的证据表明，BBB在神经系统疾病的发病和进展中起着关键作用。因此，非常需要BBB模型，该模型可以预测中枢神经系统靶向药物的渗透，并阐明BBB在健康和疾病中的作用。
我们最近将芯片上的器官和诱导多能干细胞（iPSC）技术相结合，以产生完全个性化对人类的BBB芯片。该新平台显示细胞、分子和生理特性，适用于预测药物和分子在人体BBB中的传输。此外，我们使用患者特有的BBB芯片，生成了神经系统疾病模型，并展示了个性化预测医学应用的潜力。这里提供了一个详细的协议，演示如何生成iPSC衍生的BBB芯片，从iPSC衍生的脑微血管内皮细胞（iBMECs）的分化开始，并产生包含神经祖子的混合神经培养，分化神经元和星形细胞。还描述了将细胞播种到器官芯片和在受控层流下培养BBB芯片的过程。最后，对BBB芯片分析进行了详细说明，包括用于评估药物和分子渗透性的准细胞渗透性测定，以及用于测定芯片内细胞类型成分的免疫细胞化学方法。
Introduction
BBB是一种高度选择性的屏障，将中枢神经系统与循环血液分离。它保护关键的大脑功能免受潜在的破坏性物质，因子和异种生物，同时也允许营养物质和其他代谢物的流入，以保持大脑平衡1。BBB 是一种多细胞 NVU，其中圆细胞、星形细胞端脚和神经元过程直接接触脑微血管内皮细胞 （BMECs）。这些交互允许 BMEC 形成由紧密和附着点2、3支持的专用屏障属性。这种屏障的形成限制了分子的准细胞通道，但它含有偏振的传输器，以主动将分子输送到CNS或回到血液1。由于这些独特的屏障特性，BBB是生物药物输送到大脑的主要障碍，据估计，不到5%的FDA批准的小分子可以达到CNS4。
动物模型已广泛用于研究BBB渗透和BBB开发中涉及的分子机制5。虽然动物模型忠实地表现了复杂的多细胞在体内环境，BBB运输者的表情和活性的差异，以及不同物种的基质特异性往往排除了动物数据准确地推断给人类6。因此，基于人的模型对于研究人类BBB和用于开发针对CNS的药物至关重要。随着生物、人类专用药物在制药开发领域的日益占据主导地位，这种需求变得更加明显。累积的证据表明，受损的BBB与一些严重的中枢神经系统疾病有关，包括脑肿瘤和神经系统疾病7，8，9。忠实地反映这些疾病的人类模型有可能1）确定可能针对药物开发的新途径，2）预测CNS渗透，从而减少临床前研究的时间和资源，并可能降低临床试验的失败率。
体外模型已被广泛应用，以研究BMEC与NVU其他细胞之间的相互作用，并为潜在的BBB渗透药物10进行筛选。为了重建人类BBB的关键方面，体外模型必须显示生理相关特性（即，低副细胞渗透性和生理相关的跨端面电阻[TEER]穿过内皮单层）。此外，体外系统的分子轮廓必须包括代表性功能传输系统的表达。通常，体外模型由内皮细胞组成，这些细胞在半渗透膜上与其他NVU细胞的组合共同培养，以增强BBB特性11。这种方法允许对阻隔功能和分子渗透性进行简单和相对快速的评估。这种基于细胞的BBB模型可以建立与动物或人类细胞源，包括从手术切除或永生BMEC线分离的细胞。
最近，将人类多能细胞分化为BMEC的协议被引入，作为体外人类BBB模型12、13的诱人来源。诱导多能干细胞（iPSC）衍生的BMECs（iBMECs）具有高度的可扩展性，表现出人类BBB的关键形态和功能特征，并携带患者的遗传学。在文化中，iBMECs 形成一个单层，表示紧密的交汇点标记，并在体内显示类似紧密的交汇点复合物。这些细胞也表达BBB标记，包括BBB葡萄糖转运器，葡萄糖转运器1（GLUT1）。重要的是，与人类BMECs的其他替代细胞源不同，iBMECs获取的屏障特性与在体内14测量的值一样高，沿巴索边轴极化，并表达功能外泄泵。此外，使用不同科目的 iPSC 1） 欢迎有机会以个性化医学方式测试 BBB 的各个方面，2） 为生成 NVU 的其他细胞类型提供了灵活的来源。从异源细胞源生成这些细胞以产生个性化的BBB芯片也有助于了解药物反应的个体间差异，这是导致抗药性或对临床研究中观察到的治疗反应受损的主要原因。
在盘式或半透射式跨井插入物中，将 iBMEC 用作单层，是 BBB 建模的有力方法。这些系统往往坚固、可重复且经济高效。此外，TEER 和渗透性等功能分析执行起来相对简单。然而，二维（2D）系统无法概括体内组织的3D特性，它们缺乏循环血液和血细胞提供的生理剪切应激力量。这限制了这些模型中血管内皮开发和维护内在BBB特性和功能的能力。
由活细胞排列的微工程系统已经实现，以模型各种器官功能的概念称为器官在芯片上。通过重建体内类似多细胞的架构、组织-组织界面、物理化学微环境和血管灌注，这些微工程平台产生无法与传统的 2D 文化系统。它们还支持高分辨率、实时成像和分析与体内组织和器官环境中的活细胞相似的生化、遗传和代谢特征。然而，芯片上器官的一个特别挑战是，这些微工程芯片的设计、制造和应用需要专业工程专业知识，而这些专业知识在生物学学术实验室中通常缺乏。
我们最近将iPSC和器官芯片技术相结合，生成了15、16的个性化BBB芯片型号。为了克服上述技术挑战，商用Chip-S1与培养模块一起使用，该仪器旨在以简单可靠的方式自动维护芯片（Emulate Inc.）。BBB芯片再现了神经细胞和内皮细胞之间的相互作用，并实现了生理相关的TEER值，该值由定制的器官芯片与集成的金电极17测量。此外，BBB芯片显示低副细胞渗透性，响应器官级别的炎症提示，表示活性排泄泵，并表现出可溶性生物标志物和生物药物的预测传输。值得注意的是，由几个人产生的BBB芯片捕获了健康个体与神经系统疾病患者之间的预期功能差异15。
下面详述的协议描述了一种可靠、高效和可重复的方法，用于在动态流条件下生成基于 iPSC 的 BBB 芯片。提供有关可以直接在 BBB 芯片或从取样流出物中执行的测定和端点分析类型的指导。因此，该协议演示了可用于评估人类相关模型中的生物和功能特性和响应的技术范围。
此处简要介绍了基于 iPSC 的 BBB 芯片。人类iPSC最初在组织培养瓶中作为神经祖体的自由浮动聚集体（称为EZ球体）进行分化和繁殖。芯片-S116，18，19的顶部通道被种子与分离的EZ球，形成芯片的”大脑侧”，因为细胞分化在7天的神经祖细胞（iNPCs），iAstrocyt和iNeurons的混合培养。人类 iPSC 在组织培养板中也区分为 iBMEC。芯片的底部通道与iBMECs一起播种，形成”血侧”，形成内皮管（图1）。多孔细胞外基质 （ECM） 涂层膜可分离顶部和底部通道 1），允许通道和 2 之间形成细胞与细胞之间的相互作用，允许用户使用传统的光学显微镜在任一通道中运行渗透性测定和图像单元。
Protocol
Representative Results
Discussion
NVU 中的器官片上技术和 iPSC 衍生细胞的结合为人类 BBB 的精确建模带来了希望。在这里，我们提供了一个详细的协议，用于简单和稳健地应用最近发布的基于iPSC的BBB芯片16。种子设定范式的概述和时间如图3所示。要获得和维护适合 BBB 建模的屏障函数，生成均质 iBMEC 单层并保持其完整性至关重要。迈向功能单层的第一步包括非极性PDMS表面的化学激活，允?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢索沙娜·斯文德森博士的批判性编辑。这项工作得到以色列科学基金会第1621/18年赠款、科学和技术部（MOST）、以色列3-15647、加州再生医学研究所IDDISC1-08800、谢尔曼家庭基金会、NIH-NINDS赠款1UG3NS105703和ALS协会赠款18-SI-389的支持。AH由瓦伦堡基金会资助（赠款编号2015.0178）。
Materials
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Dissociation solution |
| B27 | Gibco | 12587010 | |
| Bfgf | Peprotech | 100-18B | |
| Chip-S1 | Emulate Inc | Chip-S1 | Organ-Chip |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| Dextran-FITC | Sigma | 46944 | |
| DMEM: F12 | Thermo Fisher Scientific | 31330038 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Emulate Reagent 1 (ER-1) | Emulate Inc | ER-1 | |
| Emulate Reagent 2 (ER-2) | Emulate Inc | ER-2 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| GLUT-1 | Invitrogen | MA5-11315 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050038 | Glutamine supplement |
| hBDNF | Peprotech | 450-02 | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| mTeSR1 | StemCell Technologies, Inc. | 85851 | |
| NEAA | Biological industries | 01-340-1B | |
| Nestin | Millipore | MAB353 | |
| NutriStem | Biological industries | 05-100-1A | Alternate media |
| PECAM-1 | Thermo Fisher Scientific | 10333 | |
| Platelet-poor plasma-derived bovine serum (PPP) | Biomedical Technologies | J64483AB | |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| S100β | Abcam | ab6602 | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SCGP00525 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| ZO-1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 33-9100 | |
| βIII-tubulin (Tuj1α) | Sigma | T8660 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350010 |
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