פשוט ליתוגרפיה-ללא מיקרוהדפס תא יחיד באמצעות סטנסילים לייזר לחתוך
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטת המיקרו-ליתוגרפיה ללא הגבלה, פשוטה ונגישה לבעלי רקע ביוהנדסי מוגבל. שיטה זו משתמשת בסטנסילים מותאמים אישית לחתוך לייזר כדי מיקרו מטריצות חלבונים מטריצה בצורה של עניין עבור מודלדירוג תאים מורפולוגיות. ההליך עבור מיקרופנינג הוא הפגין באמצעות מושרה המושרה תא גזע המופק הקרדיוציטים.
Abstract
טכניקות מיקרופרינינג שימשו באופן נרחב בביולוגיה התא כדי ללמוד את ההשפעות של שליטה בצורה וגודל התא על קביעת הגורל התא ברזולוציה תא בודד. העדכנית ביותר של המדינה-של-art בודד טכניקות מיקרוגרפיה כרוכים לדפוס רך מיקרו מגע הדפסה, שהיא טכנולוגיה רבת עוצמה, אבל דורש מיומנויות הנדסה מוסמך ותמיכה מתקן מסוים במיקרו בייצור. מגבלות אלה דורשות טכניקה נגישה יותר. כאן, אנו מתארים שיטת ליתוגרפיה פשוטה וחופשית: שיטה מבוססת-סטנסיל של תא יחיד. אנו מספקים הליכים צעד-אחר-צעד, כולל עיצוב סטנסיל, ייצור פוליאקרילאמיד הידרוג’ל, התאגדות חלבון מבוססת-סטנסיל, ציפוי תאים ותרבות. שיטה פשוטה זו יכולה לשמש לתבנית מערך של רבים כמו 2,000 תאים. אנו מדגימים את הפנינג של הקרדיוציטים שמקורם באחד בתאי גזע המושרה האנושית pluripotent (היפנוטית) עם צורות תא ברורים, מ 1:1 מרובע כדי 7:1 מלבן מבוגר בצורת הקרדיוציט. זה תא בודד מבוסס סטנסיל מהתכנות הוא ללא ליתוגרפיה, טכנית חסון, נוח, זול, והכי חשוב נגיש לאלה עם רקע ביולוגי מוגבל.
Introduction
הופעתו של hiPSCs ואת הפיתוח הבאים של פרוטוקולים עבור הבידול שלהם בבימויו של סוגי תאים שונים הפכו את זה אפשרי ללמוד פיתוח ומחלות ברמה מולקולרית ומטופל ספציפי, במיוחד באמצעות החולה נגזר ipsc קרדיוציטים (ipsc-CMs) לדגם cardiomyopathies1,2. עם זאת, מגבלה מרכזית לחקר התפתחות ופיזיולוגיה באמצעות מערכת iPSC ואחרים במודלים חוץ גופית היא העדר מיקרוסביבה מובנית. באתרו, תאים חשופים האילוצים של מטריצה החילוץ (ECM), כמו גם תאים שכנים. ההרכב הביוכימי המסוים והקשיחות של מיקרוסביבות אלה מכתיבים את התפלגות המרחב של תאים, כמו גם גורמים זמינים לעוסקים הדבקה תא. זה, בתורו, משפיע תאיים מסלולים איתות, ביטוי גנים, ונחישות הגורל התא. לדוגמה, iPSC-CM מיקרותבנית בצורת מבוגר כמו מוט יש יכולת כושר טובה יותר באופן משמעותי, זרימת סידן, ארגון מיטוכונדריאלי, אלקטרופיזיולוגיה, ו-כדורית רוחבי היווצרות3. לפיכך, תכונות המיקרו-סביבה הן בלתי-מהותי בוויסות התפקודים הסלולאריים.
טכניקות המיקרו-מיקרוגרפיה הקודמות הסתמכות בכבדות על פוטוליטוגרפיה (איור 1A). בטכניקה זו, שכבה של פולימר לאור, או photoresist, הוא סובב על מצע שטוח מהפתרון כדי ליצור סרט דק על 1 יקרומטר עבה. הבא, אולטרה סגול (UV) האור מוחל על photoresist באמצעות מסכה המכילה את התבנית הרצויה. חשיפה לאולטרה סגול (UV) אור כימית משנה את הphotoresist על ידי שינוי מסיסות שלה בפתרון המפתחים בהתאמה שלה, העברת התבנית הרצויה מן המסכה על מצע. שיטות רבות למיקרו-מיקרוגרפיה משלבות פוטוליטוגרפיה, כפי שהיא משלבת ננו כדי לשלוט ברמת מיקרומטר על העיצוב של דפוסי התא. עם זאת, ספינינג של photoresist הוא רגיש מאוד זיהומים, כי חלקיקי האבק הקטן ביותר יהיה לשבש את התפשטות הפתרון לתוך סרט דק. הפוטוליתוגרפיה חייב להתבצע במתקנים לא מזוהמים, אשר יקרים לשמור ודורשים מומחיות מיוחדת כדי לנצל. בנוסף, הכימיקלים המשמשים בפוטוגרפיה הם לעתים קרובות רעילים לתאים והוא יכול לbiomolecules חשוב. לפיכך, פוטוליתוגרפיה מהווה מכשולים משמעותיים לייצור מיקרודפוסים עבור יישומים ביולוגיים נוחים.
ב 1994, Whitesides ועמיתים4 התגברו על כמה אתגרים הקשורים בפוטוגרפיה על ידי החלוצי אוסף של טכניקות שנקרא ליתוגרפיה רכה. ב ליתוגרפיה רך, משטח מובנה שנעשה עם polydiמתיל siloxane (PDMS), חומר שקוף, כמו גומי, משמש להפקת דפוס של חלבונים ECM4. טכניקות ליטוגרפיה רכות נפוצות כוללות הדפסה במיקרומגע והדפס מיקרופלואידיג. בדפוס microcontact, כיום שיטת הליתוגרפיה הרכה הפופולרית ביותר, חותמת PDMS מצופה בחלבונים של ECM מעבירה את החומר על פני השטח באזורים שאליהם נוצר החותם (איור 1B). In מיקרופלואידיג, מיקרומבנים מתוכננים על פני משטח PDMS כגון, כאשר החותמת היא לחצה על מצע, רשת של מיקרוערוצים, שדרכו ניתן להעביר נוזלים לאזורים הרצויים, נוצר (איור 1C)5. ליתוגרפיה רכה מציעה מספר יתרונות על פני פוטוגרפיה. לאחר וופל מאסטר הוא מיקרופוברק, בולים PDMS ניתן בקלות לשכפל ללא תעסוקה נוספת של מתקני חדר נקי. בנוסף, העדר ממיסים אורגניים בתהליך של ליתוגרפיה רכה מאפשר ניצול של חומרים פולימריים כגון פוליסטירן, בדרך כלל בשימוש בתרבות התא. לבסוף, מיקרוגרף שימוש בשיטות ליטוגרפיה רכות אינו מוגבל למשטחים שטוחים. לכן, ליתוגרפיה רכה מגבירה את הנגישות והפונקציונליות של ייצור מיקרותבניות על גבי פוטוליתוגרפיה6. עם זאת, ליתוגרפיה רכה יש חסרונות משמעותיים. לדוגמה, שלב התחריט ההתחלתי, שימוש בפוטוגרפיה, עדיין נדרש למיקרו-הרכיבו את החותמת. בנוסף, מיקרופילנינג באמצעות חותמת PDMS כפוף וריאציות באיכות של העברת חלבון על מצע6. הימנעות מסתירות אלה דורשת אופטימיזציה ועקביות בלחץ המוחל על החותמת של PDMS במהלך העברת החלבון, הדפורמציה אחרת ועיוות של גודל התכונה של תבניות PDMS יכול להתרחש6. יש גם דאגה עיקרית של השימוש שוב ושוב PDMS בשל ספיגת מולקולה קטנה7.
כדי למנוע באמצעות פוטוגרפיה רך ו-PDMS בולים, אנו מתארים מבוססי סטנסיל, ליתוגרפיה בודדת תא השיטה מיקרודפוס הגוברת על רבים של המכשולים הקשורים בפוטוגרפיה וליתוגרפיה רך. בשיטה זו, משמש הידרואקרילאמיד בתור מצע עבור התאגדות חלבון ECM מבוסס סטנסיל, המאפשר ציפוי סלקטיבי של היפנוסק-CMs יחיד. טכניקה זו מתאימה מאוד לחומרים פולימריים המשמשים בתנאי תרבות תאים קלאסיים. יתר על כן, עם ניקוי ותחזוקה נאותים, הסטנסילים הם הניתנים לשימוש חוזר ועמידים בפני השפלה וספיגת החלבון במהלך תהליך המיקרוייצור. לבסוף, תהליך העיבוד הוא מבחינה טכנית יציב, זול, להתאמה אישית, ונגיש לאלה ללא כישורים bioהנדסאים מיוחדים. זו טכניקה מיקרומניפולציה מבוססי סטנסיל כבר מנוצל באופן כללי ב שלנו פרסומים האחרונים מידול מגוונת cardiomyopathies8,9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים שיטת המיקרו-מיקרוגרפיה המבוססת על סטנסיל, המאפשרת בחירה יעילה של תאים חסיד. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים הפנינג של היסק-CMs ביחס אורך-לרוחב שונים על ידי מיקרופתנינג מטריקס קרום הממברנה איי החלבון על הידרואקרילאמיד הידרו עם מבחינה פיזיולוגית או פתולוגית הרלוונטיות רקמות או הסיליקו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מלגת פוסט דוקטורט מאוניברסיטת סטנפורד מחקר הבריאות המכון (חג המולד) והמכון הלאומי לבריאות (1F32HL142205-01) ל-S. L, משרד NIH של פרס פיוניר של הבמאי (LM012179-03), איגוד הלב האמריקאי הוקמה פרס החוקר (17EIA33410923), המכון לרפואת לב וכלי דם של סטנפורד, קרן הופמן ושרדינגר, ואת החטיבה סטנפורד של תרופות לב וכלי דם, המחלקה לרפואה של ס. מ. W , פרסים מן המכון הלאומי לבריאות (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) ו-טבק הקשורים מחקר תוכנית (TRDRP 27IR-0012) ל-J. C. W, איגוד הלב האמריקני (AHA) פרס פוסט דוקטורט (18POST34030106) ל H. Y, ואת המענק Hengstberger ל ט אנו מודים ד ר אנדרו אולסן שירות מיקרוסקופ מדעי המוח על התמיכה של הדמיה קונפוקלית וקד של היפנוגרף-CM. אנו מודים לח על עיצוב הסטנסיל הראשון, ייצור, תא בודד מיקרוגרף של ipsc-CM על שמיכות פוליאקרילמיד הידרוג’ל מצופה, ו הדמיה מיקוד ראשוני של המבנה סרקומר של תא יחיד מיקרותבנית ipsc-CMs.
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
