Micropatterning simple lithographie-libre à cellule unique à l’aide de stencils laser-cut
Summary
Ce protocole introduit une méthode de micropatterning sans lithographie qui est simple et accessible à ceux qui ont un fond limité de bioingénierie. Cette méthode utilise des pochoirs découpés au laser personnalisés pour micropatterniser les protéines de matrice extracellulaire dans une forme d’intérêt pour moduler les morphologies cellulaires. Le procédé pour le micropatterning est démontré utilisant les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites.
Abstract
Les techniques de micropatterning ont été largement utilisées dans la biologie cellulaire pour étudier les effets du contrôle de la forme et de la taille des cellules sur la détermination du destin cellulaire à la résolution d’une seule cellule. Les techniques actuelles de micropatterning à cellules uniques à la fine pointe de la technologie impliquent une lithographie douce et une impression micro-contact, qui est une technologie puissante, mais qui nécessite des compétences techniques de formation et un certain soutien aux installations en microfabrication. Ces limitations nécessitent une technique plus accessible. Ici, nous décrivons une méthode alternative simple sans lithographie : le modelage à cellule unique à base de pochoir. Nous fournissons des procédures étape par étape, y compris la conception de pochoir, la fabrication d’hydrogel de polyacrylamide, l’incorporation de protéine à base de pochoir, et le placage et la culture de cellules. Cette méthode simple peut être utilisée pour modeler un tableau de 2 000 cellules. Nous démontrons le modelage des cardiomyocytes dérivés des cellules souches pluripotentes induites par l’homme simple (hiPSC) avec des formes cellulaires distinctes, d’un carré de 1:1 à un rectangle adulte cardiomyocyte-like. Ce modèle à cellule unique à base de pochoir est sans lithographie, techniquement robuste, pratique, peu coûteux, et surtout accessible à ceux qui ont un fond limité de bioingénierie.
Introduction
L’avènement des hiPSC et le développement ultérieur de protocoles pour leur différenciation dirigée dans différents types de cellules ont permis d’étudier le développement et la maladie à un niveau moléculaire et spécifique au patient, en utilisant spécifiquement les cardiomyocytes iPSC dérivés du patient (iPSC-CMs) pour modéliser les cardiomyopathies1,2. Cependant, l’absence d’un microenvironnement structuré est une limitation majeure de l’étude du développement et de la physiologie à l’aide du système iPSC et d’autres modèles in vitro. In situ, les cellules sont soumises aux contraintes de la matrice extracellulaire (ECM), ainsi que des cellules voisines. La composition biochimique particulière et la rigidité de ces microenvironnements dictent la distribution spatiale des cellules aussi bien que les facteurs disponibles pour s’engager dans l’adhérence cellulaire. Ceci, à son tour, influence les voies de signalisation intracellulaires, l’expression des gènes, et la détermination du destin cellulaire. Par exemple, l’iPSC-CM micropatterned dans une forme adulte-comme la tige a une capacité contractile significativement meilleure, le flux de calcium, l’organisation mitochondriale, l’électrophysiologie, et la formation de transverse-tubule3. Ainsi, les propriétés du microenvironnement font partie intégrante de la régulation des fonctions cellulaires.
Les techniques précédentes de micropatterning reposaient fortement sur la photolithographie(figure 1A). Dans cette technique, une couche de polymère photosensible, ou photorésist, est filée sur un substrat plat de la solution pour former un film mince d’environ 1 m d’épaisseur. Ensuite, la lumière ultraviolette (UV) est appliquée sur le photorésist à l’adresse à l’intermédiaire d’un masque contenant le motif désiré. L’exposition à la lumière ultraviolette (UV) modifie chimiquement le photorésist en modifiant sa solubilité dans sa solution de développement respective, transférant le motif désiré du masque sur le substrat. De nombreuses méthodes de micropatterning intègrent la photolithographie, car elle confère le nanomètre au contrôle au niveau micromètre sur la conception des modèles cellulaires. Cependant, la rotation du photorésist est très sensible aux impuretés, parce que les plus petites particules de poussière perturberont la propagation de la solution dans un film mince. La photolithographie doit donc être effectuée dans des installations non contaminées, qui sont coûteuses à entretenir et nécessitent une expertise particulière à utiliser. En outre, les produits chimiques utilisés dans la photolithographie sont souvent toxiques pour les cellules et peuvent dénaturer des biomolécules importantes. Ainsi, la photolithographie pose des obstacles importants à la fabrication de micropatternes pour des applications biologiques pratiques.
En 1994, Whitesides et ses collègues4 ont surmonté certains des défis associés à la photolithographie en mettant en avant une collection de techniques appelées lithographie douce. Dans la lithographie douce, une surface microstructurée à base de polydimethylsiloxane (PDMS), un matériau transparent ressemblant à du caoutchouc, est utilisée pour générer un modèle de protéines ECM4. Les techniques lithographiques douces courantes comprennent l’impression de microcontacts et le modelage microfluidique. Dans l’impression microcontactique, actuellement la méthode lithographique douce la plus populaire, un timbre PDMS recouvert de protéines ECM transfère le matériau sur une surface des zones contactées par le timbre(figure 1B). Dans le modelage microfluidique, les microstructures sont conçues sur une surface PDMS de telle sorte que lorsque le timbre est pressé sur un substrat, un réseau de microcanaux, par lequel les fluides peuvent être livrés aux zones désirées, est créé (figure 1C)5. La lithographie douce offre plusieurs avantages sur la photolithographie. Une fois qu’une plaquette de maître est microfabriquée, les timbres PDMS peuvent facilement être reproduits sans autre emploi d’installations de salle blanche. En outre, l’absence de solvants organiques dans le processus de lithographie douce permet l’utilisation de matériaux polymériques tels que le polystyrène, généralement utilisé dans la culture cellulaire. Enfin, le micropatterning utilisant des méthodes lithographiques douces n’est pas limité aux surfaces plates. Ainsi, la lithographie douce augmente l’accessibilité et la fonctionnalité de la fabrication de micropatternes par rapport à la photolithographie6. Cependant, la lithographie douce a des inconvénients significatifs. Par exemple, une première étape de gravure, à l’aide de la photolithographie, est toujours nécessaire pour microfabriquer le timbre. En outre, le micropatterning à l’aide d’un timbre PDMS est sujet à des variations dans la qualité du transfert de protéines sur le substrat6. Éviter ces écarts nécessite une optimisation et une cohérence de la pression exercée sur le timbre PDMS lors du transfert de protéines, sinon la déformation et la distorsion des tailles de fonctionnalités des moules PDMS peuvent se produire6. Il ya aussi une préoccupation majeure de l’utilisation répétée de la PDMS en raison de l’absorption de petites molécules7.
Pour éviter d’utiliser la photolithographie douce et les timbres PDMS, nous décrivons une méthode de micropatterning à cellule unique sans lithographie au pochoir qui surmonte bon nombre des obstacles associés à la photolithographie et à la lithographie douce. Dans cette méthode, un hydrogel en polyacrylamide est utilisé comme substrat pour l’incorporation de protéines ECM à base de pochoir, permettant un placage sélectif de hiPSC-CMs simples. Cette technique est hautement compatible avec les matériaux polymères utilisés dans des conditions de culture cellulaire classique. En outre, avec un nettoyage et un entretien adéquats, les pochoirs sont réutilisables et résistants à la dégradation et à l’absorption des protéines pendant le processus de microfabrication. Enfin, le processus de modelage est techniquement robuste, peu coûteux, personnalisable et accessible à ceux qui n’ont pas de compétences spécialisées en bioingénierie. Cette technique de micropatterning à base de pochoir a été largement utilisée dans nos publications récentes modélisant des cardiomyopathies variées8,9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons une méthode de micropatterning sans sténographie qui permet un modelage efficace des cellules adhérentes. Dans ce protocole, nous démontrons le modelage des hiPSC-CMs dans différents rapports longueur-largeur par micropatterning îles de protéine de matrice de membrane de sous-sol sur des hydrogels polyacrylamide avec des rigidités physiologiques ou pathologiquement pertinentes de tissu ou des substrats d’élastomère à base de silicium. Cette méthode est relativement simple et très accessible…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une bourse postdoctorale du Stanford Child Health Research Institute (CHRI) et du National Institute of Health (1F32HL142205-01) à S.L, le NIH Office of Director’s Pioneer Award (LM012179-03), l’American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), le Stanford Cardiovascular Institute, la Hoffmann and Schroepfer Foundation et la Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine to S.M.W , prix de l’Institut national de la santé (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) et Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) à J.C.W, l’American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST340106) à H.Y, et la bourse Hengstberger à T.S. Nous remercions le Dr Andrew Olsen du Stanford Neuroscience Microscopy Service pour le soutien de l’imagerie confocienne du hiPSC-CM micropatternisé. Nous remercions H.Y. pour la première conception de pochoir, fabrication, micropatterning à cellule unique d’iPSC-CM sur le coverlip enrobé d’hydrogel de polyacrylamide, et l’imagerie confocale préliminaire de la structure de sarcomere des iPSC-CM micropatterned à cellule unique.
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
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