Summary

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Published: March 23, 2020
doi:

Summary

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

Abstract

פיתוח מערכת העצבים של בעלי החוליות דורש תיאום מדויק של התנהגויות סלולר מורכבות ואינטראקציות. השימוש ברזולוציה גבוהה בטכניקות הדמיה vivo יכול לספק חלון ברור לתוך תהליכים אלה באורגניזם החי. לדוגמה, ניתן לעקוב אחר תאים וצאצאים שלהם בזמן אמת כטופסי מערכת העצבים. בשנים האחרונות, פיתוחים טכניים בטכניקות ריבוי צבעים הרחיבו את סוגי השאלות שניתן לחקור. את הגישה ססגוניות במחקר ניתן להשתמש כדי לא רק להבדיל בין תאים כמו, אלא גם כדי לצבוע את הצבעים שיבוטים שונים מרובים של תאים הקשורים כי כל אחד מהם שואבים תא מחולל קדמון אחד. זה מאפשר ניתוח שושלת היוחסין של שיבוטים רבים והתנהגויות שלהם בו זמנית במהלך הפיתוח. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות מתויג תאים על בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח. הדבר שימושי במיוחד לאחר האינטראקציות הסלולריות בין תאים, שקשה לתייג בצורה מסובכת באמצעות צבעים מונחי-מיזם מסורתיים. הגישה שלנו יכולה לשמש למעקב אחר קשרי השושלת בין מספר שיבוטים שונים בו זמנית. ערכות הנתונים הגדולות שנוצרו באמצעות טכניקה זו מספקות מידע עשיר שניתן להשוותו באמצעות מניפולציות גנטיות או תרופתי. בסופו של דבר התוצאות שנוצרו יכולים לעזור לענות על שאלות סיסטמטית על איך מערכת העצבים מתפתחת.

Introduction

בשלבים המוקדמים של ההתפתחות, בריכות של תאים מיוחדים המקצועית לחלק שוב ושוב באזורים מתרבים, הפקת מערכים מגוונים של תאים ביתי. התאים שנולדו במהלך תקופה התפתחותית זו לאחר מכן להבדיל ולנסוע כדי ליצור את האיברים המתהווה. במערכת העצבים, כגון ושלתי glia להצמיח נוירונים בוגרים באזורים חדרית. כמו נוירונים לנדוד הרחק מן החדרים ובוגרים, הרקמה המתרחב בסופו של דבר יוצר את המבנים מורכבים מאוד של המוח1,2,3,4,5,6. התיאום בין חלוקת ושלתי ובידול והגירה של נוירונים יקבעו את הגודל, הצורה והתפקוד של המוח בסופו של דבר, משפיעה ישירות על התנהגות7,8,9,10. למרות ששליטה הדוקה על תהליכים אלה חיונית באופן ברור להתפתחות המוח הרגילה, המנגנונים הגלובליים המווסתים את הדינמיקה הזאת אינם מובנים היטב. כאן אנו מתארים כלי לחקר פיתוח מערכת העצבים ברזולוציה התאית, המאפשר לחוקרים להמחיש תאים מחולל קדמון ונוירונים ב vivo המוח המתפתח מתפתח עם ברייקשת ולעקוב אחר התנהגותם לאורך זמן דרך הזמן לשגות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד11. הגישה יכולה גם להיות מותאמת לדמיין חלקים אחרים של העובר המתפתח.

כדי להתבונן ולהבחין בין תאים במוח מתפתח דג זברה, יש לנו להתאים את טכניקת התיוג תא במוח11. ברייבוו bow מנצל באופן אקראי, ביטוי קומבינטורית של שלושה חלבונים פלורסנט ברורים (FPs) כדי לסמן אוכלוסיה של תאים. בעוד ביטוי ברירת המחדל של ביטוי המוח הוא אדום FP, שילוב מחדש על ידי היצורים האנזים recombinase תוצאות ביטוי של mCerulean (חלבון פלורסנט ציאן, CFP) או חלבון פלורסנט צהוב (yfp)12,13. הסכום המשולב של כל FP מבוטא בתא נותן לו גוון ייחודי, המאפשר הבחנה חזותית ברורה מתאים שכנים. בנוסף, כאשר תא מקדמון מתחלק, כל תא בת יהיה לרשת את הצבע מתא האם, הפקת שיבוטים מקודד צבע ומאפשר לחוקרים לעקוב אחר שושלת היוחסין11,14. בזמן ששימש במקור לניתוח המעגלים העצביים בעכברים12, המוח כבר ביטא במגוון רחב של אורגניזמים מודל, כולל דג זברה15.

הטכניקה שלנו בונה על תיוג ססגוניות הקודם ושיטות הדמיה לתמונה ישירה שיבוטים מקודד בצבעים לאורך זמן בחיים zebrafish. בשל שקיפות אופטית שלהם העוברים, דג דג זברה מתאים גם ניסויים הדמיה16, ומחקרים קודמים יש מנוצל המוח באמצעות בראבפיש כדי ללמוד מגוון של רקמות, כולל מערכת העצבים11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. היכולת לדמות במישרין אל תוך האורגניזם החי, יחד עם התפתחות הרחם המהירה שלהם לשעבר, לעשות דג זברה מודל יקר ערך של פיתוח בעלי חוליות. בניגוד למוח היונקים, האזור המתרבים כולו של המוח המלא של הדגים הוא זמין להדמיה ללא הפרעה לסביבה אנדוגניים שלה6. הדבר מאפשר לערוך ניסויים באורגניזם החי, ולא בהכנות מחוץ לגוף או ברקמה קבועה. בניגוד לניסויים הדמיה קבועה, במחקרים vivo לאפשר עיצוב האורך, הפקת שעות של נתונים שניתן לנתח עבור דפוסי, ובכך להגדיל את הסבירות להתבוננות אירועים נדירים יחסית. בהתאם למהירות ולאורך של האירועים המעניינים, החוקרים יכולים לבחור לבצע קצר (1 – 2 h) או ארוך (עד ~ 16 h) זמן הדמיה של ניסויים. באמצעות החום דג זברה מיזם ההלם 70 (hsp70, hsp), ביטוי המוח יכול להיות מבוקרת באופן זמני28,29. בנוסף, ביטוי הפסיפס הנגרמת על ידי מקדם זה מתאים גם לתיוג ומעקב אחר שיבוטים רבים11.

היכולת לזהות באופן חזותי שיבוטים מרובים בתוך המוח החי הוא יתרון של שיטה זו. חשוב מחקרים קודמים שחקרו את התפקיד של שיבוטים בתוך פיתוח של מערכת העצבים מנוצל וקטורים retroviral יעיל לסמן תא מחולל קדמון יחיד וצאצאו באמצעות בודד FP או אחרים בחלבון דמיינו. תיוג כזה מאפשר לחוקרים להתבונן שיבוט יחיד לאורך זמן, או בתוך מבחנה או בvivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. בניגוד לשיטות לעקוב אחר ההתנהגות של התאים בתוך שיבוט אחד, הצבעים ברורים של המוח לאפשר לחוקרים להתבונן הדינמיקה בין שיבוטים. בנוסף, על ידי שימוש בברקידה כדי לתייג שיבוטים רבים בתוך המוח, נתונים נוספים על התנהגות שבטיים נאסף ביחס לטכניקות התווית שיבוט יחיד11. וחשוב מכך, ניתן להרחיב את הגישות המתוארות כאן כדי ליצור השוואות התפתחותיות בין דגים שעברו מניפולציות גנטיות או פרמקולוגית שונות18. בסך הכל, יתרונות אלה לגרום לפקיעה זמן ב vivo קונפוקלית יקוד הדמיה של הברקשת-ביטוי דג זברה אידיאלי עבור חוקרים לחקור את הפיתוח של מערכת העצבים בעלי חוליות, במיוחד אלה המעוניינים בתפקיד של שיבוטים.

Protocol

הליכים הכרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) ב לואיס & קלארק קולג ‘. 1. הזרקת מיקרובדג עוברי להגדיר סוג פראי, בוגרים דג זברה הפרדה מין טנקים הזיווג אחר הצהריים לפני ביצוע מיקרו זריקות39,40. הכן את פת…

Representative Results

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג באמצעות vivo הדמיה מרובת הצבעים בגישה להדמיה המתוארת כאן. אנו מראים כי בראיקשת צבע מקודד שיבוטים של תאים באזור החדרית ההתרבות של הפיתוח דג זברה המוח14 (איור 1). בדרך כלל, כאשר התאים שכותרתו המוח המסומנים ה?…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחיש שיבוטים של תאים מחולל קדמון ונוירונים בפתח המוח המתפתח ולעקוב אחריהם בvivo באמצעות ברייבוו ומיקרוסקופיה מיקרוסקופית הזמן11. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה בהשוואה ללימודי חוץ גופית או לשעבר vivo היא היכולת להתבונן ישירות באזור ההתרבות של המוח בעלי החו…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לי. א. פאן, י. ליבט ו-זי טוביאס לתרומות טכניות ואינטלקטואליות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע (פרס 1553764) וקרן הצדקה של אמ. ג’יי מרדוק.

Materials

1.5mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Alfa Aesar L06690 Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50ml conical tubes Corning 352070 For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line SecureLine NMT250 For making embryo manipulators
7.5mL transfer pipet Globe Scientific, Inc. 135010
CaCl2 Sigma C3881 For E3
Cotton swabs Puritan 867-WC NO GLUE For making embryo manipulators
Cre recombinase New England Biolabs M0298M
Digital dry bath Genemate 490016-616 Used to store LMA at 40°C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes World Precision Instruments TW100F-4
Incubator Forma Scientific 3158 To maintain embryos at 28°C
Injection plate molds Adaptive Science Tools TU-1
Isotemp water bath Fisher Scientific 2320 For heat shocking embryos
KCl AMRESCO 0395 For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope Zeiss LSM710
LE agarose Genemate E3120 To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA) AMRESCO J234
Mating tanks Aquaneering, Inc. ZHCT100
Methylene blue Sigma M9140 For E3
MgSO4 Sigma 9397 For E3
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
MS-222 Tricaine-S Western Chemical, Inc. Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl J.T. Baker 4058-01 For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm) Genesee Scientific 32-107G To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red Sigma P0290
Soft stitch ring markers Clover Needlecraft, Inc. 354 For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control) Loctite 1363589 For making embryo manipulators
Syringe needles Beckton Dickinson BD329412 For dechorionating embryos

References

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Biologie du développement. 453 (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Génétique. 199 (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
  44. Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Biologie du développement. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

Play Video

Citer Cet Article
Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60593, doi:10.3791/60593 (2020).

View Video