Summary

הכנה לדוגמא במיקרומאזן קריסטל קוורץ מדידות של חלבון ומכניקה פולימר

Published: January 22, 2020
doi:

Summary

המיקרו-איזון בגביש הקוורץ יכול לספק מגוון מדויק וגמיש לסרטים בטווח מיקרון או סאב-מיקרון, הרלוונטי לחקירות בעלי חישה והסביבה, ציפויים ומדעי הפולימר. עובי המדגם משפיע על המידע שניתן להשיג מהחומר במגע עם החיישן.

Abstract

במחקר זה, אנו מציגים דוגמאות שונות של כמה דק הכנת הסרט לניסויים במיקרואיזון קריסטל קוורץ המודיעה על המידול המתאים של הנתונים וקובעת אילו מאפיינים של הסרט ניתן לכמת. המיקרו-מאזן גביש הקוורץ מציע פלטפורמה רגישה במיוחד למדידת שינויים עדינים בתכונות מסה ו/או מכניות של סרט שהוחל על-ידי התבוננות בשינויים בתהודה מכנית של גביש קוורץ בתדר גבוה. היתרונות של גישה זו כוללים את הרב-תכליתיות הניסיונית שלה, יכולת ללמוד שינויים בנכסים במגוון רחב של אורכי זמן ניסיוניים ושימוש במידות מדגם קטנות. אנו מדגימים כי, בהתבסס על עובי ולהטות את מודול השכבה שהופקדו על החיישן, אנו יכולים להשיג מידע שונה מן החומר. כאן, קונספט זה מנוצל במיוחד כדי להציג פרמטרים ניסיוניים וכתוצאה מכך חישובי המסה והגמיש של קולגן נספחת על מכלולי זהב ופוליאלקטרוליט במהלך נפיחות כפונקציה של ריכוז מלח.

Introduction

מאזן המיקרואיזון הגבישי של גביש הקוורץ (QCM) ממנף את האפקט הפיזואלקטרי של גביש קוורץ כדי לנטר את תדר התהודה שלו, התלוי בנפח המסה שעל פני השטח. הטכניקה משווה את התדר התהודה ואת רוחב הפס של חיישן AT גזור גביש קוורץ (בדרך כלל בטווח של 5 MHz)1 באוויר או נוזל לתדר רוחב פס של החיישן לאחר התצהיר של סרט. ישנם מספר יתרונות עבור שימוש QCM לחקר מאפייני הסרט דק וממשקים, כולל רגישות גבוהה למסה ופוטנציאלי שינויים אלסטי המאפיין (בהתאם אחידות לדוגמה עובי), את היכולת לבצע מחקרים באתרו2, ואת היכולת לחקור ציר זמן הרבה יותר קצר מאשר להטות מסורתי הטיה או ניתוח מכני דינאמי (DMA) בדיקת ציר זמן קצר לאחר מאפשרת התבוננות באופן שבו התגובה בציר הזמן הזה משתנה במהלך קצר מאוד (אלפיות)3 וארוך (שנים) משכי זמן4. יכולת זו מועילה לחקר מגוון תהליכים קינטית והיא גם הרחבה שימושית של טכניקות מסורתיות מסוג rheometric5,6.

הרגישות הגבוהה של QCM הובילה גם את השימוש הכבד שלה ביישומים ביולוגיים לחקור את האינטראקציות הבסיסיות של biomolecules קטן מאוד. ניתן להשתמש במשטח חיישנים בלתי מצופה או פונקציונליזציה כדי לחקור ספיחה של חלבונים; עוד יותר, ביוחישה באמצעות אירועי קשירה מורכבים בין אנזימים, נוגדנים ואפתמים ניתן לבחון על פי שינויים במסה7,8,9. למשל, הטכניקה שימש כדי להבין את הטרנספורמציה של ושלפוחיות לשומנים מישורי bilayer כתהליך דו-שלבי של ספיחה של נוזלים המכילים שלפוחיות למבנה נוקשה על ידי התבוננות בשינויים הקשורים בתדירות ובגמישות אלסטיות10. בשנים האחרונות, QCM הציע בנוסף פלטפורמה חזקה כדי לפקח על אספקת סמים על ידי שלפוחיות או חלקיקים11. בהצטלבות של הנדסת חומרים וביולוגיה מולקולרית ותאית, אנו יכולים להשתמש ב-QCM כדי להבהיר אינטראקציות מפתח בין חומרים ורכיבים ביו-אקטיביים כגון חלבונים, חומצות גרעין, ליפוזומים ותאים. לדוגמה, ספיחה חלבון כדי ביומטריה במורד התגובות הסלולר כגון דלקת משמש לעתים קרובות כאינדיקטור חיובי של biocompatibility, ואילו במקרים אחרים מצורף חלבון לציפוי ממשק עם דם יכול לגרום קרישה מסוכן בכלי12,13. לפיכך, ניתן להשתמש ב-QCM ככלי לבחירת מועמדים אופטימליים לצרכים שונים.

שתי גישות משותפות לביצוע ניסויים ב-QCM אוספות נתונים מקובלים מהניסוי: הגישה הראשונה מתעדת את משמרת התדר ואת רוחב הפס החצי (Γ) של הפסגה החשמלית. הגישה השנייה, QCM עם פליטת (QCM-D), מתעדת את משמרת התדר ואת פקטור הפיזור, אשר פרופורציונלי ישירות Γ דרך המשוואה 1,14

Equation 11

כאשר D הוא גורם הפיזור ו מואייסיב הוא התדר. הן D ו Γ קשורים אפקט השיכוך הסרט יש על החיישן, אשר נותן אינדיקציה לנוקשות של הסרט. הכתב התחתי n מציין את התדר או הרמוני, שהם תדרי התהודה המוזרים של חיישן הקוורץ (n = 1, 3, 5, 7…). לדיון נוסף במודלים המשתמשים בהרמוניה מרובה, ניתן למצוא את המסה והתכונות האלסטיים של הסרט בסקירה של יוחנן בן14 ומסמכים קודמים מקבוצת שובל15,16,17,18.

שיקול מפתח אחד להכנת דגימות QCM הוא כיצד להחיל את הסרט הדק על משטח החיישן. כמה שיטות נפוצות כוללות ציפוי ספין, ציפוי מטבל, ציפוי ירידה, או ספיחה של הסרט על פני החיישן במהלך הניסוי19,20. ישנם ארבעה אזורים לדגימות QCM: מגבלת Sauerbrey, משטר הגמיש, המשטר הצובר והמשטר העילי. עבור סרטים דקים מספיק, מגבלת Sauerbrey חל, כאשר התדירות משמרת (Δמואייסיב) מספק את הצפיפות המסה של פני השטח של הסרט. בתוך מגבלת Sauerbrey, תדירות משמרת המאזניים ליניארי עם הרמוני התהודה, n, ושינויים מקדם השיכוך (D או Γ) הם בדרך כלל קטנים. במשטר זה לא ניתן למצוא מידע מספיק כדי לקבוע באופן ייחודי את המאפיינים הרטילוגיים של השכבה מבלי לקבל הנחות נוספות. נתונים במשטר זה משמשים כדי לחשב את הצפיפות המסה של פני השטח (או עובי אם הצפיפות ידועה הפריורי) של הסרט. במשטר הצובר, שבו המדיום במגע עם הגביש הוא עבה מספיק, גל האוונזאת מפיץ את הגל לתוך המדיום לפני שהוא מוכנס לגמרי. כאן, לא ניתן להשיג מידע המוני באמצעות Δמואייסיב. עם זאת, באזור זה, מאפיינים גמישים הגמיש נקבעים באופן אמין באמצעות שילוב של Δמואייסיב ו ΔΓ 15,18. במשטר בצובר, אם המדיום הוא נוקשה מדי, הסרט להלח את התהודה של החיישן, מונע את האוסף של כל הנתונים האמינים מ QCM. המשטר הגמיש והנידק הוא המשטר המתווך שבו הסרט הוא רזה מספיק כדי לקבל את גל ההטיה במלואו דרך הסרט, כמו גם ערכים אמינים עבור הגורם החשמלי. מקדם השיכוך ו Δמואייסיב ניתן להשתמש כדי לקבוע את המאפיינים אלסטי וגמיש של הסרט, כמו גם המסה שלה. כאן, מאפיינים גמישים וגמיש מקבלים על ידי תוצר של הצפיפות ואת הגודל של מודול ההטיה המורכבת | G* | p ואת השלב זווית שניתנו על ידי Φ = arctan (g “ / g“). כאשר הסרטים מוכנים במגבלת Sauerbrey, ניתן לחשב את האזור מסה לכל יחידה בהתבסס על משוואת Sauerbrey המוצגת מתחת ל-21,

Equation 22

כאשר Δמואייסיבn הוא השינוי בתדר התהודה, n הוא הטון של עניין, מואייסיב1 הוא תדירות התהודה של החיישן, Δm / A הוא המסה לאזור של הסרט, ו- Zq הוא עכבה אקוסטית של קוורץ, אשר בשנת לחתוך קוורץ הוא Zq = 8.84 x 106ק ג / m2s. המשטר הגמיש והגמישה מתאים ביותר לחקר הסרטים הפולימריים, ומגבלת הכמויות היא שימושית ללימוד פולימר בנפח22 או פתרונות חלבון16. המשטרים השונים תלויים בתכונות של חומר העניין, עם העובי האופטימלי באופן מיטבי, ובדרך כלל הולך וגובר עם קשיות הסרט. איור 1 מתאר את ארבעת האזורים ביחס לצפיפות אריאל של הסרט, מודול הטיה מורכבים, וזווית הפאזה, שם הנחנו מערכת יחסים ספציפית בין זווית השלב ואת קשיות הסרט כי הוכח להיות רלוונטי לחומרים מסוג זה. סרטים רבים של התעניינות מעשית עבים מדי ללימוד התכונות האלסטיים של הגמיש עם QCM, כגון ביואמים מסוימים, שבהם העוביים מסודרים על פי הסדר של עשרות עד מאות מיקרון23. סרטים עבים כאלה הם בדרך כלל לא מתאימים ללמוד באמצעות QCM, אבל ניתן למדוד באמצעות מהדהד בתדר נמוך יותר (כגון המאיירים)23, המאפשר גל להטות להפיץ עוד לתוך הסרט.

כדי לקבוע איזה משטר רלוונטי למדגם qcm נתון, חשוב להבין את הפרמטר dn , שהוא היחס של עובי הסרט (ד) כדי להטות את אורך הגל של תנודה מכנית של חיישן גביש קוורץ (λn)15,16,18. המשטר האידיאלי האלסטי גמיש הוא dn = 0.05-0.218, שבו ערכים מתחת 0.05 נמצאים בתוך המגבלה Sauerbrey וערכים לעיל 0.2 גישה למשטר בצובר. תיאור קפדני יותר של dn מסופק במקום אחר15,18, אבל זה פרמטר כמותי להתוות את המגבלה Sauerbrey ואת המגבלה אלסטי הגמיש. תוכניות הניתוח המשמשות להלן מספקות פרמטר זה ישירות.

יש כמה מגבלות נוספות לניתוח סרטים דקים עם QCM. Sauerbrey והחישובים אלסטי וגמיש להניח את הסרט הוא הומוגנית הן ברחבי עובי הסרט ולרוחב על פני השטח אלקטרודה של QCM. בעוד הנחה זו עושה את זה מאתגר ללמוד סרטים שיש להם חללים או מילוי נוכח, היו כמה חקירות QCM לסרטים המורכב של חלקיקים מושתל6. אם ההטרוסקסואלים קטנים בהשוואה לעובי הסרט הכולל, ניתן להשיג באופן אמין מאפיינים אלסטיים של המערכת המורכבת. למערכות הטרוגניות נוספות, יש לצפות בערכים המתקבלים מניתוח גמיש ובזהירות רבה. באופן אידיאלי, התוצאות שהתקבלו ממערכות עם טרוגניות לא ידוע צריך להיות מאומת נגד מערכות אשר ידועים להיות הומוגנית. זוהי הגישה שאנו לקחנו במערכת הדוגמה המתוארת במאמר זה.

נקודה חשובה שאנו ממחישים במאמר זה היא התכתובת המדויקת בין מדידות QCM שנעשו בתחום התדרים (כאשר Γ מדווח) והניסויים בתחום הזמן (כאשר D מדווחים). תוצאות משני ניסויים QCM שונים, תחום אחד בזמן ותחום תדר אחד, מתוארים, כל אחד מעורב שונה אך מושגית מערכת הקשורים מודל. המערכת הראשונה היא דוגמה פשוטה של קולגן המצורף לחיישן כדי להמחיש את הקינטיקה כריכה הנציגה ואת השפה של ספיחה לאורך זמן במהלך תחום הזמן (qcm-D) מדידה. קולגן הוא החלבון הנפוץ ביותר בגוף, ידוע צדדיות שלה של התנהגויות קשירה מורפולוגיה. פתרון הקולגן המשמש כאן אינו דורש פונקציונליות נוספת של משטח הזהב של החיישן כדי לגרום ספיחה9. המערכת הניסיונית השנייה היא קומפלקס פוליאלקטרוליט (מורכב מקלקר) המורכב מפוליסטירן מוקצף (PSS) ומפולי (דיאלאילדימונומוניום) (PDADMA) שהוכנו באותה צורה כמו Sadman ואח ‘22. חומרים אלה להתנפח ולהיות רך מלח (KBr במקרה זה) פתרונות, המציעה פלטפורמה פשוטה ללימוד מכניקה פולימר באמצעות גישה תחום תדר (QCM-Z). עבור כל פרוטוקול, תהליך ההכנה, הנקיטת והניתוח של מדידה מוצג באיור 2. הסכמטי מראה כי ההבדל העיקרי בין הגישות QCM-Z ו-QCM-D הוא בשלב איסוף הנתונים והמכשור המשמש בניסוי. כל טכניקות ההכנה לדוגמה המוזכרות תואמות לשתי הגישות, וכל גישה יכולה לנתח דגימות בשלושת האזורים המתוארים באיור 1.

הנתונים שלנו מדגימים כי הכנת דגימות, בין אם על ידי ציפוי חיישן לפני או במהלך מדידה, מכתיב את היכולת לחלץ את התכונות האלסטי הגמיש של מערכת. על ידי עיצוב השלבים המוקדמים של הניסוי כראוי, אנו יכולים לקבוע איזה מידע אנחנו יכולים לאסוף במדויק במהלך שלב הניתוח.

Protocol

QCM-D קולגן וספיחה 1. הכנה לדוגמא וסנסור טרום ניקוי הכינו 20 מ ל של 0.1 מאגר אצטט M, התאמת ה-pH עם HCl ו NaOH לפי הצורך כדי להשיג pH = 5.6. הוסף העכבר זנב החולדה פתרון ל 20 מ ל של מאגר אצטט תחת תנאים סטריליים לריכוז הסופי של 10 μg/mL. נקו את חיישן הקוורץ המצופה בזהב להסרת ח?…

Representative Results

השינויים בתדר עם הזמן במהלך התצוגה ספיחה חלבון מאפיין עקומת הרמה המוצגת באיור 3א-ב. שטיפת המאגר הראשונית של 1x PBS על פני שטח החיישן החשוף משרה רק שינויים זניחים בתדר, המציע קו בסיס קבוע כדי לשמש כהפניה לנקודות נתונים עתידיים. המבוא של פתרון קולגן גורם ספיחה חלבון להת…

Discussion

תוצאות הקולגן מSauerbrey ומשטרי הגמיש. על ידי התוויית התדר משתנה מנורמל למספר ההרמוני המתאים, אנו מתבוננים כי המגבלה Sauerbrey מחזיקה נכון עבור כ 2 ה הראשון של המדידה. עם זאת, עם המסה גוברת הקפדה על החיישן, עם זאת, תדירות מנורמלת עבור הרמוני השלישי והחמישי להתחיל לסטות אחד מהשני (t > 2 h), המציין את ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי NSF (DMR-1710491, אס-1743748). E.S. ותמיכת הNSF (DMR-1751308).

Materials

Acetic acid Sigma-Aldrich A6283 For collagen adsorption
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 221228 For collagen adsorption
Aqueous QCM probe AWSensors CLS 00050 A For polyelectrolyte swelling
Collagen I Rat Protein, Tail Thermo Fisher Scientific A1048301 For collagen adsorption
Distilled water Sigma-Aldrich EM3234 For polyelectrolyte swelling; generally easy to acquire in research labs, but there is a catalog number in case it is not accessible
Ethanol Sigma-Aldrich 793175-1GA-PB For polyelectrolyte swelling
Gibco Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 20012-027 For collagen adsorption
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 For collagen adsorption
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763 For collagen adsorption
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06-666A For polyelectrolyte swelling
NP2K VNA Makarov Instruments For polyelectrolyte swelling
Poly(diallyldimethylammonium chloride), MW 200,000 Sigma-Aldrich 409022 For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Poly(styrene-sulfonate) sodium salt 30% weight in water Sigma-Aldrich 561967-500G For polyelectrolyte swelling; for full synthesis procedure see Sadman et al.
Potassium Bromide Sigma-Aldrich 793604-1KG For polyelectrolyte swelling
QSense QCM Explorer System Biolin Scientific For collagen adsorption
Sodium acetate, anhydrous Sigma-Aldrich S2889 For collagen adsorption
Spin coater, Model WS-650MZ-23NPP Laurell technologies For polyelectrolyte swelling

References

  1. Marx, K. A. Quartz crystal microbalance: A useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution – Surface interface. Biomacromolecules. 4 (5), 1099-1120 (2003).
  2. Kleber, C., Hilfrich, U., Schreiner, M. In situ QCM and TM-AFM investigations of the early stages of degradation of silver and copper surfaces. Applied Surface Science. 253 (7), 3712-3721 (2007).
  3. Yeh, C. J., Hu, M., Shull, K. R. Oxygen Inhibition of Radical Polymerizations Investigated with the Rheometric Quartz Crystal Microbalance. Macromolecules. 51 (15), 5511-5518 (2018).
  4. Sturdy, L. F., Yee, A., Casadio, F., Shull, K. R. Quantitative characterization of alkyd cure kinetics with the quartz crystal microbalance. Polymer. 103, 387-396 (2016).
  5. Delgado, D. E., Sturdy, L. F., Burkhart, C. W., Shull, K. R. Validation of quartz crystal rheometry in the megahertz frequency regime. Journal of Polymer Science, Part B: Polymer Physics. , 1-9 (2019).
  6. Bilchak, C. R., Huang, Y., Benicewicz, B. C., Durning, C. J., Kumar, S. K. High-Frequency Mechanical Behavior of Pure Polymer-Grafted Nanoparticle Constructs. ACS Macro Letters. 8 (3), 294-298 (2019).
  7. Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. Energy dissipation kinetics for protein and antibody-antigen adsorption under shear oscillation on a quartz crystal microbalance. Langmuir. 14, 729-734 (1998).
  8. Liss, M., Petersen, B., Wolf, H., Prohaska, E. An aptamer-based quartz crystal protein biosensor. Analytical Chemistry. 74 (17), 4488-4495 (2002).
  9. Felgueiras, H. P., Murthy, N. S., Sommerfeld, S. D., Brás, M. M., Migonney, V., Kohn, J. Competitive Adsorption of Plasma Proteins Using a Quartz Crystal Microbalance. ACS Applied Materials and Interfaces. 8 (21), 13207-13217 (2016).
  10. Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).
  11. Olsson, A. L. J., Quevedo, I. R., He, D., Basnet, M., Tufenkji, N. Using the quartz crystal microbalance with dissipation monitoring to evaluate the size of nanoparticles deposited on surfaces. ACS Nano. 7 (9), 7833-7843 (2013).
  12. Xu, X., Zhang, C., Zhou, Y., Cheng, Q. L. J., Yao, K., Chen, Q. Quartz crystal microbalance study of protein adsorption on chitosan, chitosan/poly(vinyl pyrrolidone) blends and chitosan-graft-poly(vinyl pyrrolidone) surfaces. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 22, 195-206 (2007).
  13. Weber, N., Pesnell, A., Bolikal, D., Zeltinger, J., Kohn, J. Viscoelastic properties of fibrinogen adsorbed to the surface of biomaterials used in blood-contacting medical devices. Langmuir. 23, 3298-3304 (2007).
  14. Johannsmann, D. Viscoelastic, mechanical, and dielectric measurements on complex samples with the quartz crystal microbalance. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (31), 4516-4534 (2008).
  15. Denolf, G. C., Sturdy, L. F., Shull, K. R. High-frequency rheological characterization of homogeneous polymer films with the quartz crystal microbalance. Langmuir. 30 (32), 9731-9740 (2014).
  16. Martin, E. J., Mathew, M. T., Shull, K. R. Viscoelastic properties of electrochemically deposited protein/metal complexes. Langmuir. 31 (13), 4008-4017 (2015).
  17. Sturdy, L., Casadio, F., Kokkori, M., Muir, K., Shull, K. R. Quartz crystal rheometry: A quantitative technique for studying curing and aging in artists’ paints. Polymer Degradation and Stability. 107, 348-355 (2014).
  18. Sadman, K., Wiener, C. G., Weiss, R. A., White, C. C., Shull, K. R., Vogt, B. D. Quantitative Rheometry of Thin Soft Materials Using the Quartz Crystal Microbalance with Dissipation. Analytical Chemistry. 90 (6), 4079-4088 (2018).
  19. Wasilewski, T., Szulczyński, B., Kamysz, W., Gębicki, J., Namieśnik, J. Evaluation of three peptide immobilization techniques on a qcm surface related to acetaldehyde responses in the gas phase. Sensors (Switzerland). 18 (11), 1-15 (2018).
  20. Lvov, Y., Ariga, K., Kunitake, T., Ichinose, I. Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption. Journal of the American Chemical Society. 117 (22), 6117-6123 (1995).
  21. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik. 155 (2), 206-222 (1959).
  22. Sadman, K., Wang, Q., Chen, Y., Keshavarz, B., Jiang, Z., Shull, K. R. Influence of Hydrophobicity on Polyelectrolyte Complexation. Macromolecules. 50 (23), 9417-9426 (2017).
  23. Sievers, P., Moß, C., Schröder, U., Johannsmann, D. Use of torsional resonators to monitor electroactive biofilms. Biosensors and Bioelectronics. 110, 225-232 (2018).
  24. Ringberg, J. Q-Sense Explorer Operator Manual. Biolin Scientific. , (2017).
  25. Ringberg, J. Q-Sense User Guide: Instrument care and sensor pre-cleaning. Biolin Scientific. , (2015).
  26. Kern, W. The Evolution of Silicon Wafer Cleaning Technology. Journal of The Electrochemical Society. 137 (6), 1887 (1990).
  27. Sadman, K. . sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI: QCMD-Analyze. , (2018).

Play Video

Citer Cet Article
dePolo, G. E., Schafer, E., Sadman, K., Rivnay, J., Shull, K. R. Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics. J. Vis. Exp. (155), e60584, doi:10.3791/60584 (2020).

View Video