Denne protokol indeholder detaljerede eksperimentelle skridt til at etablere en tre-dimensionel in vitro kultur af blæretumor organoider stammer fra kræftfremkaldende-induceret murine blærekræft. Kultur metoder, herunder passaging, genteknologi, og ortotoptransplantation af tumor organoider er beskrevet.
Udviklingen af avancerede tumormodeller har længe været opmuntret, fordi de nuværende kræftmodeller har vist begrænsninger såsom mangel på tredimensionel (3D) tumorarkitektur og lav relevans for kræft hos mennesker. Forskere har for nylig udviklet en 3D in vitro kræft model benævnt tumor organoids, der kan efterligne de særlige kendetegn ved en indfødt tumor i en kultur parabol. Her, eksperimentelle procedurer er beskrevet i detaljer for etablering af blæretumor organoider fra en kræftfremkaldende-induceret murine blære tumor, herunder kultur, passage, og vedligeholdelse af den resulterende 3D tumor organoider in vitro. Desuden er protokoller til at manipulere de etablerede blæretumor organoid linjer for genteknologi ved hjælp af lentivirus-medieret transduktion er beskrevet, herunder optimerede betingelser for effektiv indførelse af nye genetiske elementer i tumor organoider. Endelig er proceduren for ortotoptransplantation af blæretumor organoider ind i væggen af murine blæren til yderligere analyse er lagt ud. De metoder, der er beskrevet i denne artikel kan lette etableringen af en in vitro model for blærekræft til udvikling af bedre terapeutiske muligheder.
Blærekræft er den mest udbredte urinvejskræft, med ca 165.000 patienter dør årligt1. Blandt de forskellige typer af blærekræft, muskel-invasiv urothelial karcinom udviser en aggressiv fænotype, og dens 5 år overlevelsesrate er lavere end 50%2. Nye terapeutiske muligheder for invasive uroteltumorer er ikke blevet udvidet i løbet af de sidste par årtier1.
Kræft celle linjer har været flittigt brugt til narkotika screening3. Selv om gunstige resultater er blevet observeret i mange lægemiddelkandidater i kræft cellelinjer, dårlige resultater er rapporteret i kliniske forsøg4. Efter øget tilpasning til in vitro to-dimensionelle (2D) kultur miljøer, er det blevet stadig vanskeligere at opsummere indfødte tumorer i cellelinjer. Dyrekræft modeller eller patient-afledt tumor xenografts kan bruges til at løse de begrænsninger, der observeres i blærekræft cellelinjer. Men, animalsk kræft modeller er tid og ressourcekrævende. Derfor har forbedrede sygdomsmodeller været på efterspørgslen i årevis, og der er udviklet et nyt modelsystem, organoider, for at afhjælpe manglerne ved eksisterende modeller5.
En organoid er en multicellulær 3D konstruktion, der kan opsummere in vitro de fysiologiske egenskaber af dens tilsvarende in vivo organ. Normale og tumor organoids kan udledes af enten pluripotente eller voksne stamceller, og primære tumorceller, henholdsvis5,6. I løbet af de sidste mange år, tumor organoids er blevet etableret fra et stort antal forskellige tumorvæv7, herunder kolon8,9, blære10,bugspytkirtel11,12, prostata13, lever14, og bryst15 tumor væv. Sådanne tumor organoider efterligne deres oprindelige tumorer fænotypisk og genetisk. På grund af deres lighed med in vivo tumorvæv og deres mange praktiske anvendelser, forskere har vedtaget dem som nye sygdomsmodeller i studiet af kræft patogenese.
Her er procedurerne for etablering af tumororganoider fra en kræftfremkaldende-induceret murine invasiv urotellial tumor16 lagt ud. N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamin (BBN) anvendes som kræftfremkaldende til at fremkalde invasiv urotelkarcinom i mus17 og tumororganoider, som udviser de patologiske egenskaber ved musemuskel-invasive blæretumorer, er etableret fra BBN-induceret murine blærekræft16. Metoden til genetisk manipulere tumor organoids er illustreret ved hjælp af lentivirus-medieret transduktion til at udvikle en model system til at studere det molekylære grundlag for udviklingen af blærekræft. Desuden er en metode til transplantation organoids ortotopisk i en blære til at undersøge den rolle, som den indfødte blære miljø i blærekræft er beskrevet.
Denne protokol beskriver de eksperimentelle procedurer for kultur og vedligeholde blæretumor organoider stammer fra kræftfremkaldende-induceret murine blære tumorer.
I denne protokol er der flere eksperimentelle trin, hvor procedurerne kan have brug for fejlfinding. For det første er antallet af tumorceller, der oprindeligt er seedet, en kritisk faktor, fordi lavt antal tumorceller i kultur (<2 x 104 celler) for det meste fører til celledød på grund af manglende interaktioner mellem tumorceller. I modsætning hertil, begyndende med alt for mange celler (> 5 x 104 celler) ved såning fører til overfyldte organoider, hvilket resulterer i vanskeligheder ved håndtering af kulturer med dårlig vækst af hver organoid. Det foreslås kraftigt, at der i begyndelsen etableres flere plader med forskellige antal celler for at optimere forsøgsbetingelserne. Identifikation af det rigtige antal indledende tumorceller er afgørende for at opnå den højeste celle levedygtighed og for at etablere en vellykket blæretumor organoider. Også, i langsigtet kultur på over 2 uger uden passaging, de fleste tumor organoider stoppe voksende, potentielt på grund af utilstrækkelig forsyning af næringsstoffer i midten af organoider og udtynding af vækstfaktor i kælderen membran matrix. Derfor, subculturing organoider i tide er et kritisk skridt til at opretholde tumor organoid kultur.
For det andet, produktionen af høj-titer lentivirale partikler er afgørende for en effektiv genetisk manipulation af tumor organoider. At foretage fejlfinding af virustiterrelaterede problemer foreslås det kraftigt, at virustiters bestemmes før viral transduktion hver gang, fordi lentivirale konstruktioner har tendens til at producere virale partikler med varierende effektivitet. Hvis tumor organoider udviser lav levedygtighed efter virusinfektion, er det sandsynligt, at de virale titers er potentielt for høj. Det er stærkt foreslået at bruge lavere mængde virus i dette tilfælde. For det tredje, under ortotoptransplantation af BBN-induceret blæretumor organoider, Det er afgørende at opretholde integriteten af blærevæggen. Hvis injektionen når blærens lumen ved at trænge ind i blærevægslaget, skal forsøget afsluttes og kasseres. Hvis det er muligt, monitorering af blæretumor vækst ved hjælp af en ultralyd imaging system anbefales.
En begrænsning af de nuværende teknikker er fraværet af tumor mikromiljø eller stroma i disse organoids. For at løse dette problem, Det er stærkt foreslået, at ortotoptransplantation af tumor organoider bruge en in vivo system til at efterligne den indfødte tumor mikromiljø. I fremtiden vil det være nødvendigt at udvikle 3D in vitro organoid systemer, der er sammensat af tumor organoids med andre komponenter af tumor stroma.
En af de største konsekvenser af vores teknik er, at, i ortotoptransplantation af tumor organoider, kun 10 blæretumor organoider kan fremkalde tumor vækst i blæren. Sammenlignet med de konventionelle tumortransplantation eksperimenter, der kræver 5 x 105-1 x 106 enkelt blære tumorceller, vores metoder er langt mere effektive og robuste. En anden væsentlig forskel er, at organoider kan manipuleres forskelligt ved hjælp af forskellige lentivirale vektorer, såsom lentivirale konstruktioner, der indeholder korthårede RNA, CRISPR-Cas9-systemet eller gener af interesse. Disse ville være kraftfulde værktøjer til at tilføje til nuværende organoid teknologi. Samlet set kan de eksperimentelle tilgange præsenteres her lette etableringen af in vitro tumor modeller, der kan forbedre vores forståelse af patogenesen af blærekræft i stedet for at bruge 2D blærekræft cellelinjer.
Denne metode var i stand til at etablere blæretumor organoids stammer fra en kræftfremkaldende-induceret murine blære tumor. Artiklen giver en beskrivelse af lentivirus-medieret eksperimentelle procedurer, hvorigennem de genetiske modifikationer er indført og stably vedligeholdes i blæretumor organoider. Desuden er en procedure for ortotoptransplantation af tumororganoider inkluderet. I kombination med nuværende in vivo kræft modeller, denne teknik vil være et nyttigt redskab til at studere det molekylære grundlag af blære tumorigenese.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Research Foundation of Korea til K.S: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Leading Technology Development Programme for Kreativ økonomi (SF317001A), POSCO (2018Y06) og BK21 Plus Forskningsstipendium.
0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
24-well plate | Corning | 3526 | |
29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
Cyrovial | Corning | 430488 | |
DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
Razor blade | |||
Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |