小鼠膀胱肿瘤器官的培养、操作和正交移植

所有程序均根据 POSTECH 机构动物护理和使用委员会的准则（IACUC 编号：POSTECH-2019-0055）获得批准和进行。 1. 膀胱肿瘤器官的体外培养 建立从鼠膀胱肿瘤的膀胱肿瘤器官 （图 1A).注：产生BBN诱导小鼠膀胱肿瘤的程序在Shin等人中概述。17.在暗瓶中向小鼠提供0.1%含BBN的水，为期6个月。每周2次更换含BBN的水。注：使用8~10周体重约25克的C57BL/6雄性小鼠。含BBN的水可以在一个笼子里给最多五只老鼠施用。 6个月后，使用吸入二氧化碳对小鼠实施安乐死，并分离出整个膀胱肿瘤。将其转移到 90 毫米培养皿中。 使用无菌手术剪刀去除非癌性部位和坏死区，用冷1x Dulbeco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）洗涤膀胱肿瘤片段2-3次。收集碎片，并转移到一个新的90毫米培养皿。 加入1 mL的Dulbecco的改性最小必需介质（DMEM），10m M 4-（2-羟基乙）-1-烟碱硫酸（HEPES）。 使用消毒的剃须刀将肿瘤组织切成尽可能小（0.5–1 mm3）的碎片。 加入 9 mL 的 DMEM，带 10 mM HEPES、250 μg/mL 胶原酶 I 型、250 μg/mL 胶原酶 II 型和 250 U/mL 热利辛。在孵化器（37°C，5%CO2）的轨道摇床上孵育切碎的肿瘤组织1.5-2小时，将碎片分离到细胞悬浮液中。将细胞悬浮液转移到50 mL管中。注：如果从小鼠采集的肿瘤大小大于1cm3，用热化素量的2倍处理或增加孵育时间。 在 4°C 下将管在 400 x g下离心 5 分钟，然后吸出上清液。 使用5 mL氯化铵-钾（ACK）赖舍缓冲液重新悬浮颗粒，以赖化任何红血球。在室温（RT）下孵育管3~5分钟，直到红血球完全变坏。注：如果未观察到红血球，则省略莱沙过程。 将 20 mL 的 DMEM 添加到管中。在 4°C 下将管在 400 x g下离心 5 分钟，然后吸出上清液。 用 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和 10 μM Y-27632 二盐酸 （Y-27632） 重新悬浮颗粒，将颗粒分离成单个细胞。在 37°C 水浴中孵育管 5 分钟。注：在显微镜下观察肿瘤，以确认完全分离到单个细胞。如果细胞块仍然存在，进一步移移悬浮液。 使用10 mL的DMEM与10%胎儿牛血清（FBS）中和胰蛋白酶。通过新 50 mL 管上的 100 μm 细胞过滤器过滤细胞悬浮液，以清除未消化的碎片。 在 4°C 下将管在 400 x g下离心 5 分钟，然后吸出上清液。 使用150μL的冷生长因子在24孔板中涂上一口井，减少基底膜基质（材料表），并将24孔板放入孵化器（37°C，5%CO2）30分钟，以凝固基底膜基质。注：在4°C下解冻并保持基底膜基质，以防止使用前凝固。 使用 1 mL DMEM 重新悬浮颗粒，并使用血细胞计对细胞计数。将3⁄4 x 104肿瘤细胞转移到冰上1.5 mL微管中。 在 4°C 下将微管在 400 x g下离心 3 分钟，并小心地丢弃上清液。 用500μL的预加热有机体介质（表1）和10μM Y-27632重新悬浮细胞，并将其转移到涂层井中。将 24 孔板放入培养箱（37 °C，5% CO2）。 额外的膀胱肿瘤细胞可以储存1mL的DMEM，含有10S、1%青霉素/链霉素和10%二甲基亚硫酸盐（DMSO），在1.5 mL冷冻液中。将它们放入冷冻容器中，并将容器转移到 -80°C 冷冻箱中。在冷冻室中储存过夜后，将冷冻液转移到液氮中，以便长期存放。 使用500 μL的预加热有机体介质每2天更换一次介质（图1B）。 亚培养膀胱肿瘤器官。注：建议膀胱肿瘤器官在直径达到100~150μm时通过。 在24孔板中加入500μL的胶原酶/消糖，加入肿瘤有机体。上下移液的基底膜基质和介质。在37°C下孵育20分钟，将细胞收获到15 mL管中。注：在显微镜下检查从地下室膜基质分离的有机物。如果有机物未从基底膜基质分离，则增加孵育时间或移液器更多次。 加入5 mL的预预热DMEM，在4°C下以400 x g离心管3分钟，然后吸出上清液。 使用 1 mL 预热 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和 10 μM Y-27632 重新悬浮颗粒。在37°C水浴中孵育5分钟。大力移液细胞上下和中和胰蛋白酶使用5 mL的DMEM与10S。 在 4°C 下将管在 400 x g下离心 3 分钟，然后吸出上清液。 使用预热的有机物介质的1 mL重新悬浮颗粒，并计算单个肿瘤细胞的数量。 重复步骤 1.1.14_1.1.18。 2. 利用伦蒂病毒介导的细胞肿瘤器官的遗传操作（图2A） 生产GFP表达的慢病毒颗粒。 在第0天，在细胞系培养基中，每10厘米细胞培养板的密度为5~6 x 106细胞的板HEK 293T细胞（即具有10S和1%青霉素/链霉素的DMEM）。 在第1天，制备DNA转染溶液，包括转移含有GFP（8μg）、慢病毒包装质粒（10μgpCMVR 8.74和3μgpMD2.G），以及1 mL的减量血清培养基（材料表）。 根据制造商的说明，每1μg总质粒添加3μL转染试剂（材料表），并通过移液轻轻混合。在 RT 孵育 20 分钟，并在 10% FBS 下添加 9 mL 的 DMEM。 用HEK 293T细胞在细胞培养板中吸出培养基。小心地将10 mL的DNA转染溶液转移到HEK 293T细胞上，并在37°C的细胞培养箱中孵育。 第3天，在荧光显微镜下观察细胞（488nm的激发和512nm的排放），以确定转染效率。在整个细胞群中，几乎90%~100%的细胞应表达GFP。 收集上清液（包含病毒），用0.45 μm聚醚素（PES）过滤器过滤上清液。注：使用低蛋白结合过滤器，如PES过滤器。 为了集中病毒，在旋转桶转子（材料表）中，在4°C下在超离心机中，将病毒上清液在98，768 x g处离心2小时，并小心地丢弃上清液。 在2.5 mL的冷有机物介质中重新悬浮颗粒。 对于长期储存，将250μL的慢病毒介质等分放入低温小瓶中，并使用液氮进行卡冻。将冷冻病毒储存在-80°C冷冻箱中。 对膀胱肿瘤器官进行慢病毒介导转导。 在第2天，分裂肿瘤器官如上文所述（步骤1.2）12小时之前，慢透病毒介导转导。 第3天，在37°C水浴中快速解冻含有病毒的等分（步骤2.1.9），并加入含有10μM Y-27632和8 μg/mL六甲甲酰胺溴化物的250μL有机物介质。 用500μL的含病毒介质替换24孔板中的有机体培养基，并在孵化器（37°C，5%CO2）中孵育12-16小时。 在第4天，用500μL的新鲜有机物介质更换介质。注：孵育12~16小时后，应改变培养基，因为含有扁豆病毒和六甲甲酰胺的培养基是细胞毒性的。 第6天，在荧光显微镜下转导3天后，监测肿瘤器官的GFP信号（图2B）。 第10天，通过并储存器官后7天转导步骤1.2，以保持转基因肿瘤有机体线。 3. 膀胱器官的正交移植（图3A） 准备膀胱肿瘤器官进行正交移植。 移植前，培养膀胱肿瘤器官5~7天，如上所述（步骤1.2）。 在24孔板中加入500μL的胶原酶/消糖，在24孔板中加入肿瘤有机体。上下移液的基底膜基质和介质。在37°C下孵育20分钟，并将细胞收集到15 mL管中。 加入5 mL的预预热DMEM，在4°C下以400 x g离心管3分钟，然后吸出上清液。 用 1 mL 的 DMEM 重新悬浮颗粒，并将溶液转移到 90 mm 培养皿中。 在显微镜下，使用p200微移液器拾取10-100个肿瘤有机体，并将其收集到冰上的微管中。 在 4°C 下将管在 400 x g下离心 3 分钟，并小心地丢弃上清液。 在冰上保持细胞颗粒，直到小鼠准备好手术。 亚粘体膀胱壁移植注：此过程由 Fu 等人18发布的协议修改。 在实验前至少1周准备一只8到10周大的雄性裸鼠（CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl），让它适应新的环境。在手术前24小时注射苯丙他素（5毫克/千克）。 用肥皂和水清洁台面。在手术前对手术器械进行高压灭菌，并使用无菌器械进行手术。 将 29 G 胰岛素注射器、移液器尖端和基底膜基质放在冰上。在麻醉前，先在皮下施用酮洛芬（5毫克/千克）。 在感应室中用4%的异常胶麻醉小鼠。一旦达到一般麻醉，将鼠标置于一个苏巴的位置，并通过面罩吸入2%蒸发的异常胶维持麻醉。注：如果麻醉时间超过30分钟，使用棉签涂抹眼药膏，避免角膜干燥。 用无菌纱布涂抹化碘，并用70%乙醇擦拭。每次用新纱布或棉签重复3次。 使用一次性无菌手术窗帘覆盖手术场和手术场。 使用解剖显微镜放大，用无菌手术剪刀在下中线腹部的皮肤和肌肉壁进行小横向切口（小于 1.5 厘米）。从腹腔暴露膀胱，用盐水浸泡的棉签支撑膀胱。注：如果膀胱充满尿液，轻轻按膀胱以稍微解压。 在含有50%高浓度基底膜基质（材料表）的80μL有机物介质中重新悬浮有机物颗粒（步骤3.1.7）。 使用29G胰岛素注射器在解剖显微镜下将有机体悬浮液注射到膀胱圆顶的前部。 用抗菌吸收缝合线关闭腹壁的内层，然后用4-0尼龙缝合封闭外层。用波维酮碘和70%乙醇对手术部位进行消毒。 让鼠标在红外辐照器下恢复 10-15 分钟。 手术后一天，检查小鼠的一般状况和麻醉性渗漏。术后3天每天服用酮洛芬（5毫克/千克），术后10天每天一次治疗苯丙沙星（5毫克/千克）。 当切口部位愈合（手术后10-14天）时，切除缝合线。监测小鼠膀胱肿瘤在肿瘤器官注射后2-3周的生长。 如果观察到膀胱肿瘤生长，使用吸入二氧化碳对小鼠实施安乐死，并收获整个膀胱肿瘤。使用冷 DPBS 清洗 （图 3B）16. 为了分析膀胱肿瘤组织学，使用血氧素和欧辛（H和E）染色染色（图3B）16染色组织石蜡嵌入部分。