인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포
Summary
우리는 3개의 간단한 시험관내 분석-장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석, 및 화학-유도 분석-인간 줄기 세포 유래 의 기능을 집합적으로 평가하는 시험관 내 외 내피 세포 및 그들의 GABAergic 인터 뉴런과 상호 작용.
Abstract
신경계 발달과 뇌 질환의 병인학에서 뇌 혈관의 역할은 점점 더 주목받고 있습니다. 우리의 최근 연구는 혈관 세포의 특별한 인구를 확인했다, 심실 내피 세포, 그 배아 발달 동안 전뇌 GABAergic 인터뉴런의 마이그레이션 및 분포에 중요한 역할을. 이것은, 그들의 세포 자율 기능과 더불어, 정신 분열증, 간질 및 자폐증 같이 신경 정신병학 무질서의 병리에 있는 심실 내피 세포의 새로운 역할을 암시합니다. 여기에서, 우리는 집합적으로 상피실 내피 세포의 기능 및 GABAergic interneurons와의 그들의 상호 작용을 평가하는 3개의 다른 시험관내 검문학을 기술했습니다. 이러한 검소의 사용, 특히 인간의 맥락에서, 우리는 심실 내피 세포와 뇌 질환 사이의 링크를 식별 할 수 있습니다. 이 어설션은 간단하고, 저렴하며, 재현 가능하며, 모든 부착 세포 유형에 쉽게 적응할 수 있습니다.
Introduction
내피 세포는 혈관의 안대기를 형성하고 혈관 벽 투과성의 유지 보수, 혈류 조절, 혈소판 응집 및 새로운 혈관형성을 포함하는 중요한 기능을 중재합니다. 뇌에서, 내피 세포는 단단히 뇌와 혈류 량 사이의 물질의 교환을 제어하는 중요한 혈액 – 뇌 장벽의 일부를 형성1. 지난 10 년간 우리의 연구는 두뇌 발달및행동2,3,4,5를위한 중요한 연루가 있는 두뇌 내피 세포의 새로운 신경성 역할을 확인했습니다 . 우리는 마우스 배아 전뇌가 해부학, 기원 및 발달 프로필2에서다른 혈관, pial 혈관 및 심실 혈관의 두 가지 별개의 특수형에 의해 혈관화되는 것으로 나타났습니다. 이 2개의 혈관 특수형을 일렬로 세우는 내피 세포는 그들의 유전자 발현 단면도에 있는 명백한 다름을 보여줍니다. 피알 내피 세포는 주로 염증 및 면역 반응과 관련된 유전자를 발현하는 반면, 내피 세포는 신경 발생, 신경 이동, 화학변증 및 축세포유도와일반적으로 연관된 유전자의 발현에서 유일하게 풍부하다. 심실 내피 세포는 또한 전통적인 신경 GABA 신호 통로에서 구별되는 새로운 GABA 신호 통로를 수용5. 그것의 유전자 발현과 수반, 상외 내피 세포는 개발 신피질에서 GABAergic 인터뉴런의 이동 및 분포를 조절하는 것으로 나타났다. 배아 발달 동안, 심실 내피 세포는 심실 혈관 네트워크2,3을확립하기 위해 복부 등쪽 구배를 따라 장거리 이동을 겪는다. 이 철새 경로는 하루 후 인터뉴런에 의해 미러됩니다. 인터뉴런을 이동하는 것은 미리 형성된 심실 혈관 네트워크와 물리적으로 상호 작용하고 신피질에서 최종 목적지에 도달하기 위한 가이드레일로 사용합니다. 물리적 기질로 작용하는 것 이외에, 상피내피 세포는 뉴런을 이동하기위한 탐색 단서의 소스 역할을합니다. 상피 내피 세포 분비 GABA는 인터 뉴런 마이그레이션을 안내하고 최종 분포 패턴을 조절4. 인터뉴런 이동 및 분포의 결함은 자폐증, 간질, 정신 분열증 및 우울증6,7,8,9,10과같은 신경 정신 장애와 관련이 있습니다. 따라서, 상복부 내피 세포 기능의 연구와 인간의 맥락에서 인터 뉴런 이동에 미치는 영향은 이러한 장애의 발병 기전을 해결하기위한 중요하게된다.
우리 실험실11에서인간 배아 줄기세포로부터 인간 심상외형 내피세포를 생성하였을 때, 유도된 만능 줄기세포(iPSC) 기술12,13을이용하여 생성하였다. 인간 심상외 외 피실 내피 세포가 마우스 심구 내피 세포를 충실하게 모방하는지 확인하고, 간 신경 세포 이동에 미치는 영향을 정량적으로 평가하기 위해, 우리는 세 가지 시험관 내 분석분석( 장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석 및 화학 적 매력 분석)을 개발했습니다. 여기에서 우리는 이 분석에 대한 프로토콜을 자세히 기술합니다. 세 가지 모든 측정법은 실리콘 배양 인서트의 사용을 기반으로 세포가 없는 공간으로 둘러싸인 작은 직사각형 세포 패치(고정 치수)를 생성합니다. 마이그레이션 거리는 0일째에 설명된 직사각형 패치의 테두리로부터 셀의 최종 위치 사이의 거리를 측정하여 평가됩니다. 장거리 이동 분석에서, 인간 심실 내피 세포는 35 mm 접시의 중심에 패치로 시드되고, 오랜 시간 동안 세포에 의해 이동된 거리가 계산된다. 공동 배양 이동 분석에서, 인간 심실 내피 세포는 35 mm 접시에 하나의 패치로 인간 인터뉴런과 공동 시드된다. 이 설치는 interneurons의 이동의 비율에 이 두 세포 모형의 직접적인 물리적 상호 작용의 효력의 시험을 허용합니다. 화학 적 매력 분석 인간 심구 내피 세포에 의해 분비 된 화학 매력적인 단서에 대한 응답으로 인터 뉴런의 이동을 측정합니다. 인터뉴런은 직사각형 패치로 시드되고, 인간 심상 외 내피 세포와 함께 양쪽에 비슷한 크기의 패치로 시드된 비-심실 내피 세포를 제어합니다. 각 세포 패치는 500 μm의 세포 없는 간격에 의해 분리됩니다. interneurons의 반응은 비-periventricular 내피 세포를 대조하기 위하여 비교된 심실 내피 세포로 이동한 세포의 수를 정량화해서 평가됩니다.
이 해약은 인간 periiicular 내피 세포 기능및 interneuron 이동에 대한 그들의 영향의 강력한 평가를 제공합니다. 새로운 장거리 분석 및 공동 배양 이동 분석법은 센티미터(~1-1.5cm) 범위의 무세포 공간을 제공하여 장거리 이동을 감지할 수 있도록 합니다. 다른 인기 있는 어세이에 비해 당사의 검사의 특징에 대한 요약은 표 1에제시되어 있다. 집합적으로, 여기에서 기술된 계산은 정신 분열증, 자폐증 또는 간질 같이 두뇌 무질서의 iPSCs에서 생성된 “병든” 내피 내피 세포 및 interneurons를 평가하기 위한 발판으로 봉사할 것입니다. 이 계산은 또한 어떻게 다른 조건 (예를 들면 억제제, 리간드, RNAi)가 세포 이동에 영향을 미치는지 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 마지막으로, 이 측정은 장거리 이동, 화학 적 인매력 또는 세포 매개 이동을 측정하기 위하여 그밖 세포 모형을 위해 최적화될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 우리는 함께 인간 심실 내피 세포 특이적 특성의 정량적 평가를 제공하는 3개의 시험관내 분석시험을 기술했다. 이 해약은 인간 interneurons와 인간 적인 심실 내피 세포의 상호 작용에 기계론적인 통찰력을 얻기에 귀중할 것입니다. 리간드, 억제제 또는 유전자 특이적 녹다운 또는 과발현을 가진 세포를 이용한 실험은 내피 세포 유도 된 세포 유도 인터뉴런 이동 또는 심실 내피 세포의 장거…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 정신 건강 연구소 (R01MH110438)와 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (R01NS100808)에서 AV에 대한 상을 지원했습니다.
Materials
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
References
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