Summary

Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

Published: October 26, 2021
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo de prueba de inmunohistoquímica para la detección del antígeno del virus de la rabia como una prueba diagnóstica alternativa para los tejidos fijos con formalina.

Abstract

Una de las principales modalidades diagnósticas para la rabia es la detección del complejo de ribonucleoproteína viral (RNP) (antígeno) en las muestras de tejido infectadas. Si bien la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) o la prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT) se utilizan con mayor frecuencia para la detección de antígenos, ambas pruebas requieren tejidos frescos y / o congelados para impresiones en diapositivas antes de la detección de antígenos con anticuerpos. Si las muestras se recogen y se fijan en formalina, ninguna de las pruebas es óptima para la detección de antígenos, sin embargo, las pruebas se pueden realizar mediante inmunohistoquímica convencional (IHC) después de incrustar en bloques de parafina y seccionamiento. Con este método IHC, los tejidos se tiñen con anticuerpos antirrábicos, las secciones se desparafinan, el antígeno se recupera mediante proteólisis parcial u otros métodos, y se incuba con anticuerpos primarios y secundarios. Los antígenos se tiñen con peroxidasa de rábano picante / amino etil carbazol y se contrateñen con hematoxilina para la visualización utilizando un microscopio de luz. Además de la detección específica de antígenos, la fijación de formalina ofrece otras ventajas como la determinación de cambios histológicos, condiciones relajadas para el almacenamiento y transporte de muestras (bajo temperatura ambiente), capacidad para probar casos retrospectivos y una mayor seguridad biológica a través de la inactivación de agentes infecciosos.

Introduction

La rabia es una encefalitis progresiva aguda causada por los virus de ARN de sentido negativo pertenecientes al género lyssavirus1. Casi el 99% de todas las muertes humanas causadas por la infección con el virus de la rabia (RABV), el miembro tipo del género, es transmitida por perros2. El diagnóstico de rabia de animales sospechosos se basa en la detección de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viralmente, proteína N) en complejo con ARN genómico (complejo ribonucleoproteína, RNP) en el tejido cerebral3. La detección de antígenos mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) se considera el estándar de oro para el diagnóstico de la rabia4. El método utiliza material cerebral fresco o fresco congelado, una impresión táctil en una diapositiva, fijación en acetona, tinción utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales (mAbs/pAbs) de isotiocianato fluorescente (FITC) disponibles comercialmente y leídos por la microscopía de fluorescencia5. La prueba DFA es rápida, sensible y específica para la detección de antígenos de rabia en tejido cerebral fresco. Recientemente, se demostró que una prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT), técnica de inmunohistoquímica modificada (IHC), exhibe una sensibilidad similar a la DFA, pero ofrece la ventaja de la microscopía de luz para la visualización6. Si bien el método de detección utilizado en DRIT es similar al IHC, el paso inicial utiliza tejidos frescos o congelados para generar impresiones táctiles de la muestra seguidas de fijación en formalina.

IHC es una técnica ampliamente utilizada para determinar cambios histológicos y la detección de proteínas utilizando anticuerpos específicos en tejidos fijos con formalina incrustados en bloques de parafina. IHC es una prueba alternativa establecida para la detección del antígeno de la rabia en las secciones de tejido7. La IHC se ha utilizado particularmente para el diagnóstico de casos retrospectivos que exhibieron enfermedades neurológicas para determinar la carga de la rabia8. Los tejidos fijados en formalina incrustados en parafina preservan las proteínas para la detección incluso después de varios años cuando se almacenan a temperatura ambiente9. El tratamiento con formalina modifica las proteínas mediante la reticulación y alteración de las cadenas laterales de aminoácidos, lo que podría hacer que los epítopos ya no sean reactivos contra los anticuerpos10. Si bien la prueba IHC para la detección de antígenos de rabia involucra mAbs o pAbs, este último es ventajoso ya que se pueden detectar múltiples epítopos y lissavirus divergentes11.

Los pasos estándar involucrados en la IHC son la fijación de formalina de los tejidos, la incrustación en bloques de parafina, la seccionamiento de los tejidos, la desparafinación y la hidratación, la recuperación del epítopo, la reactividad contra los anticuerpos primarios y secundarios, y el desarrollo utilizando sustratos cromogénicos. Este manuscrito describe una descripción detallada del protocolo para el diagnóstico de la rabia. Para la detección de antígenos de la rabia, se utiliza suero de ratón inmunizado con RABV (pAbs) generado en los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos en Atlanta, Georgia, en combinación con anticuerpos secundarios biotinilados contra ratones. Los abs biotinilados se detectan mediante la adición del complejo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) seguido del desarrollo del color con sustrato de amino-etilcarbazol.

Protocol

Si bien el protocolo IHC se realizó en tejidos fijos con formalina, que inactiva el RABV si está presente, se deben seguir adecuadamente los protocolos de bioseguridad apropiados. Todos los procedimientos de bioseguridad se describen en la 5ª edición de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluido el uso de equipo de protección personal (EPP) adecuado y el requisito de vacunación como se describe12. Ade…

Representative Results

La Figura 2 muestra resultados representativos de tinción de IHC de muestras de control positivas y negativas en diferentes tejidos cerebrales analizados. La Figura 2A, D, G representa muestras positivas a 200x, mientras que la Figura 2B, E, H corresponde a un aumento de 400x, respectivamente. Figura 2A-C corresponden a…

Discussion

Debido a la alta tasa de mortalidad de la rabia después del inicio de los síntomas, el diagnóstico de animales sospechosos de infección por RABV es extremadamente crítico para un tratamiento profiláctico adecuado después de la exposición. El diagnóstico de la rabia depende principalmente de técnicas basadas en DFA, DRIT y PCR que utilizan tejidos frescos o congelados. Para las pruebas de tejidos fijos con formalina, la prueba IHC proporciona un método alternativo para la detección sensible y específica del a…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los laboratoristas, epidemiólogos y afiliados de los departamentos de salud pública por las presentaciones de muestras a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. Los hallazgos y conclusiones de este informe son los de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. El uso de nombres comerciales y fuentes comerciales son solo para identificación y no implican el respaldo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades.

Materials

3% hydrogen peroxide Pharamacy brands Off the shelf 3% H2O2
3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) Millipore Sigma A6926
Acetate Buffer pH 5.2 Poly Scientific R&D Corp. s140
Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered Fisher Scientific SF100-4 Certified
Cover slips Corning Fisher Scientific 12-553-471 24 X 50 mm
Ethanol 190 Proof Pharmco-AAPER 111000190
Ethanol 200 Proof Pharmco-AAPER 111000200
Gill's hematoxylin formulation #2 Fisher Scientific CS401-1D
HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit seracare 71-00-18 Mouse Primary Antibody 
ImmunoHistoMount Millipore Sigma i1161 Mounting media
N,N, Dimethyl formamide GR Fisher Scientific D119
Phosphate Buffered Saline  HyClone RR14440.01 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective Multiple vendors
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective Multiple vendors
Pronase Millipore Sigma 53702 Protease, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water  Poly Scientific R&D Corp. s1887
Tissue-Tek Slide stain set Fisher Scientific 50-294-72
TWEEN-80  Millipore Sigma P1754
Xylene Fisher Scientific X3S-4 Histological Grade
Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope Multiple vendors

References

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Citer Cet Article
Niezgoda, M., Subbian Satheshkumar, P. Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues. J. Vis. Exp. (176), e60138, doi:10.3791/60138 (2021).

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