Uma abordagem de alimentação de anticorpos para estudar o tráfico de receptores de glutamato em culturas hipocampais primárias dissociadas

As células utilizam o processo ativo de tráfico para mobilizar proteínas para localizações subcelulares específicas e exercer rigorosa regulação espaciotemporal sobre sua função¹. Esse processo é especialmente importante para os receptores transmembranares, pois as respostas celulares a diferentes estímulos ambientais dependem de cascatas intracelulares desencadeadas pela ativação do receptor. As células são capazes de modificar essas respostas alterando a densidade, localização e composição da subunidade de receptores expressos na superfície celular através da regulação do tráfico subcelular receptor². A inserção de receptores recém-sintetizados na membrana plasmática, juntamente com a endocitose e a reciclagem de receptores existentes são exemplos de processos de tráfico que determinam o pool líquido de receptores expressos na superfície². Muitos mecanismos moleculares cooperam para regular o tráfico de proteínas, incluindo interações proteína-proteína e modificações pós-translacionais, como fosforilação, ubiquitinação ou palmitilação².

A regulação do tráfico de receptores é particularmente necessária em células fortemente polarizadas com estruturas altamente especializadas. O exemplo paradigmático é o controle da função neuronal pelo tráfico regulamentado de receptores de glutamato (glurs)^3,4. O glutamato, o principal neurotransmissor excitatória, liga e ativa os GluRs expressos em superfície para controlar funções neuronais fisiológicas fundamentais, como neurotransmissão sináptica e plasticidade sináptica. O fato de que o tráfico de GluR alterado tem sido observado em um amplo espectro de neuropatias, variando de distúrbios do neurodesenvolvimento a doenças neurodegenerativas, destaca a importância desse processo⁵. Assim, compreender os acontecimentos moleculares que controlam o tráfico de GluR é de interesse em muitas áreas de pesquisa.

Neste protocolo, um método baseado anticorpo-alimentando é usado para quantificar o nível de GluRs superfície-expressados em neurônios hippocampal preliminares assim como para avaliar como as mudanças na internalização e na reciclagem resultam na expressão líquida observada da superfície. O uso de farmacologia e/ou superexpressão de receptores exógenos que abrigando mutações específicas torna este protocolo uma abordagem particularmente poderosa para o estudo de mecanismos moleculares subjacentes à adaptação neuronal a diferentes estímulos ambientais. Um exemplo final da utilidade deste protocolo é estudar como as mudanças multifatoriais no ambiente (como em modelos de uma doença) afetam o tráfico de GluR através do exame da expressão de superfície em tais modelos.

Usando exemplos específicos, é demonstrado inicialmente como uma manipulação farmacológica que imita a estimulação sináptica physiological [LTP químico (CLTP)] aumenta a expressão de superfície da subunidade endógena do GluA1 do AMPA-tipo de glurs (ampars) ⁶. o tráfico de uma forma fosfomimética superexpressa da subunidade GluN2B do NMDA-tipo de GluRs (NMDARs) também é analisado para exemplificar como esse protocolo pode ser usado para estudar a regulação do tráfico de GluR por Modificações. Embora estes exemplos específicos sejam usados, este protocolo pode facilmente ser aplicado a outros glurs e outros receptores e proteínas que possuem domínios extracelular antigénicos. No caso de não existirem anticorpos disponíveis para os domínios extracelulares, a superexpressão do epitope-etiquetado extracelular (por exemplo, as proteínas Flag-, Myc-, GFP-Tagged, etc.) podem auxiliar na rotulagem de proteínas.

O protocolo atual fornece instruções para quantificar a densidade específica do subtipo GluR e o tráfico usando anticorpos específicos. Este protocolo pode ser utilizado para estudar 1) expressão de superfície GluR total, 2) internalização GluR e 3) reciclagem de GluR. Para estudar cada processo individualmente, é aconselhável começar com as secções 1 e 2 e continuar com a secção 3, 4 ou 5. Em todos os casos, termine com as secções 6 e 8 (Figura 1).