在这里,我们提出了一个协议,以精确形成血源内皮,从人类多能干细胞在馈送和异种条件下。该方法在治疗性化合物的疾病建模和筛选中有着广泛的应用。
从人类多能干细胞(PSCs)中提取功能性造血干细胞和祖细胞(HSPCs),是治疗血液学和恶性疾病的自体移植的一个难以捉摸的目标。造血内皮(HE)是一个可调节的平台,通过转录因子产生功能性HSPCs或以稳健的方式诱导淋巴细胞。然而,目前派生HE的方法要么成本高,要么产量变化。在此协议中,我们建立了一种经济高效、精确的方法,在无馈线和异种定义的条件下在 4 天内得出 HE。由此产生的HE经历了内皮到造血的过渡,并产生了CD34+CD45+造血造物原代。我们平台在生成功能性HSPCs方面的潜在能力将在疾病建模和治疗化合物筛查方面得到广泛应用。
血液学和免疫学疾病新疗法的开发因缺乏可靠的疾病建模平台和来自患者的自体造血干细胞 (HSC) 的高通量药物筛查而受阻多能干细胞。诱导(i)PSC技术的突破有望从患者细胞中模拟疾病,但从患者iPSC中建立功能性HSC一直难以实现。为了从人类PSC获得HSC,胚胎模式和转录程序的正确诱导是关键1,2,3,4,5,6, 7,8.造血发育的最新进展表明,造血内皮(HE)在HSC开发中的作用9。他可以从PSC诱导,并适合下游干预,如基因转移10,11,12,13。以HE为平台,结合5个转录因子(ERG、HOXA5、HOXA9、LCOR、RUNX1)的组合,成功地诱导了长期移植并分化成多个谱系的功能HSC。然而,从PSC生成多变和低效的HE,阻碍了细胞的系统操作和分析,以及现成的生产和大规模诱导用于临床的造血细胞。
在这里,我们描述了一种经济高效且精确的方法,在 4 天内通过无进料和异种定义条件得出 HE。在这种方法中,在iMarix-511上球形形成和自发再扁平化可确保PSC菌落的一致密度,这对HE细胞的有效诱导至关重要。
我们的无馈线和异种定义感应方法提供了一个精确且经济高效的平台,以可扩展的方式诱导 HE 细胞。在常规协议10、11、12、13、14中,由于对PSC菌群密度和大小缺乏精确控制,血原内皮形成的忠实形成,影响形态原/细胞因子定向分化的效率。从常规协议中,我们在每个独立批次中都经历了造血内皮诱导的不一致。新方案对PSC菌群密度和尺寸进行严格调节,克服了造血内皮诱导的不一致性。
我们利用球体的制服形成,随后在总共4天内传达了无馈线和异种的确定条件,形成HE。我们确认使用三个独立的细胞系,球形形成确保HE细胞的一致形成。作为代表性的结果,409B2细胞系在三个独立实验的基础上产生了12.7%-23.6%CD34+细胞效率。平铺 PSC 球体的关键因素是 LM511-E8。我们不建议用其他矩阵替换,例如在我们的经验中,Matrigel 或全长拉米宁产品。我们体验到,间皮器官很容易从母体分离,并在分化过程中丢失。而且,没有预涂层,Matrigel 或全长拉米宁都不会锚定细胞。
该协议的潜在限制是,我们依靠 PSC 维护介质来维护 PSC。我们已经测试了其他介质,如StemFit,但我们妥协了造血诱导。在我们的短时间(4天)诱导协议中,细胞可能抵抗从多能状态退出。如果在其他介质中维护PSC,我们建议在PSC维护介质中调整细胞,并在分化前进行几个通道。该平台将允许对细胞进行系统操作和分析,并生产出现成和大规模诱导造血细胞,供潜在的临床使用。该系统的一个长期目标是在人化小鼠模型中模拟免疫缺陷疾病,以研究负责任的细胞和分子机制,并进行药物筛选。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢李爱丽和本诺精工的技术援助。我们还要感谢渡边昭一女士提供行政援助,感谢彼得·卡拉吉安尼斯博士编辑了这份文件。这项工作得到了日本医学研究和发展机构(AMED)(M.K.S.)的再生医学实现研究中心网络iPS细胞研究中心的核心支持。利用。AMED (17935423) [M.K.S.] 和日本科学技术厅创新中心项目 (R.O. 和 M.K.S.) 的特异性 iPS 细胞。
0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5M EDTA |
40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B |
anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
Stemline Ⅱ Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |