Generation af inducerede neurale stamceller fra perifere mononukleære celler og differentiering mod dopaminerge neuron-prækursorer til transplantations studier

Parkinsons sygdom (PD) er en almindelig neurodegenerativ lidelse, forårsaget af degeneration af dopaminerge (DA) neuroner på substantia nigra pars Compacta (SNpc) i ventrale mesencephalon (VM), med en prævalens på mere end 1% i populationen over 60 år ^{1 , 2}. i løbet af det seneste årti, celleterapi, der har til formål enten at erstatte de degenerative eller beskadigede celler, eller nærende mikromiljø omkring degenererede neuroner, har vist potentiale i behandling af PD³. I mellemtiden har omprogrammering teknologi gjort betydelige fremskridt⁴, som giver en lovende cellulære kilde til substitutionsterapi. Humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) og embryonale stamceller (ESCs) har vist sig at være i stand til at differentiere sig i DA neurale celler, som kunne overleve, modnes, og forbedre motoriske funktioner, når podet i rotte og ikke-humane primat PD modeller^{5 ,6,7,8}. iPSCs repræsenterer en milepæl i cellulære omprogrammering teknologier og har et stort potentiale i celletransplantation; Men, der er stadig en bekymring over risikoen for tumordannelse fra ufuldstændigt differentierede celler. En alternativ cellulær kilde til celletransplantation er Lineage-forpligtede voksne stamceller opnået gennem direkte omprogrammering, såsom inducerede neurale stamceller (iNSCs), som kan udledes af de ustabile mellemprodukter, uden om pluripotens etape^9,10,11.

Både ipscs og inscs kan omprogrammeres fra autologt cellulære kilder, såsom fibroblaster, mononukleære celler i perifert blod (pbmncs) og forskellige andre typer af celler^12,13,14, hvilket reducerer immunogenicitet af transplanterede celler i stor grad. Desuden, sammenlignet med iPSCs, iNSCs er iboende med reduceret risiko for tumordannelse og Lineage-engageret plasticitet, kun i stand til at skelne til neuroner og glia¹¹. I de indledende undersøgelser, humane eller mus ipscs og inscs blev genereret fra fibroblaster opnået fra hudbiopsier, som er en invasiv procedure^14,15. Med denne respekt, PBMNCs er en tiltalende starter celle kilde på grund af den mindre invasive prøvetagning proces, og den lethed at opnå et stort antal celler inden for en kort periode med ekspansion tid¹⁶. Indledende omprogrammering undersøgelser ansat Integrative levering systemer, såsom lentiviral eller antiretroviral vektorer, som er effektive og nemme at implementere i mange typer af celler¹⁷; disse leveringssystemer kan dog forårsage mutationer og reaktivering af rest transgener, som frembyder sikkerhedsproblemer til kliniske terapeutiske formål¹². Sendai virus (SeV) er en ikke-Integrativ RNA-virus med en negativ fornuft, enkelt-strandede genom, der ikke integreres i Host genom, men kun replikater i cytoplasmaet af inficerede celler, tilbyder et effektivt og sikkert køretøj til omprogrammering^{18 ,19}. Rekombinant SeV vektorer er tilgængelige, der indeholder omprogrammering faktorer, herunder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-MYC i deres åbne læse rammer. Desuden kan de virale vektorer forbedres yderligere ved at indføre temperaturfølsomme mutationer, så de hurtigt kan fjernes, når dyrknings temperaturen hæves til 39 °C²⁰. I denne artikel beskriver vi en protokol til at omprogrammere PBMNCs til iNSCs ved hjælp af SeV-systemet.

Mange undersøgelser har rapporteret afberegning af da neuroner fra humane esc’er eller ipscs ved hjælp af forskellige metoder^6,8,21. Der er imidlertid mangel på protokoller, som beskriver differentieringen af DA-neuroner fra iNSCs i detaljer. I denne protokol vil vi beskrive den effektive generation af DA neuroner fra iNSCs ved hjælp af en to-trins metode. DA neuronal prækursorer kan transplanteres i striatum af PD musemodeller for sikkerhed og effektivitet evalueringer. Denne artikel vil præsentere en detaljeret protokol, der dækker forskellige stadier fra generation af induceret neurale stamceller af Sendai virus, differentiering af iNSCs ind i DA neuroner, etablering af mus PD modeller, til transplantation af DA prækursorer i striatum af PD-modellerne. Ved hjælp af denne protokol kan man generere iNSCs fra patienter og raske donorer og udlede DA neuroner, der er sikre, standardiserbare, skalerbare og homogene til celletransplantation formål, eller til modellering PD i en skål og undersøgelse af mekanismerne underliggende sygdomsudbrud og-udvikling.