Burada kuduz aşılarında immünojenik glikoprotein içeriğini belirlemek için dolaylı bir ELISA sandviç immünoyakalama açıklar. Bu test glikoprotein düzelticileri tanıyan nötralize monoklonal antikor (mAb-D1) kullanır. Üretim sırasında aşı potens tutarlılığını takip etmek için in vivo NIH testine alternatiftir.
Hayvan refahı için giderek artan küresel endişe üreticileri ve Ulusal Kontrol Laboratuvarları (OMCLs) Değiştirme, Azaltma ve Laboratuvar hayvan testleri arıtma için 3Rs stratejisi takip teşvik etmektedir. Kuduz aşısı nın gücünü değerlendirmek için NIH testine alternatif olarak dSÖ ve Avrupa düzeylerinde in vitro yaklaşımların geliştirilmesi önerilmektedir. Kuduz virüsü (RABV) partikülünün yüzeyinde glikoprotein indükleyicileri Viral Nötralize Antikorları (VNAb) oluşturmak için büyük immünojeni oluşturur. Monoklonal Antikorların (mAb-D1) glikoproteinin trimerik formunu tanıdığı bir ELISA testi, aşı serilerinin üretimiyle birlikte yerli katlanmış trimerik glikoproteinin içeriğini belirlemek için geliştirilmiştir. Bu in vitro potens testi NIH testi ile iyi bir uyum gösterdi ve RABV aşı üreticileri ve OMCLs tarafından ortak çalışmalarda uygun bulunmuştur. Hayvan kullanımından kaçınmak yakın gelecekte ulaşılabilir bir hedeftir.
Sunulan yöntem, trimerik RABV glikoproteininin iii (aa 330-338) antijenik bölgelerini tanıyan mAb-D1 kullanılarak dolaylı elisa sandviç immünoyakalamasına dayanmaktadır. mAb-D1, aşı da bulunan glikoprotein düzelticilerin hem kaplaması hem de tespiti için kullanılır. Epitop konformasyonel özellikleri nedeniyle tanındığından, potansiyel olarak denatüre glikoprotein (daha az immünojenik) mAb-D1 tarafından yakalanıp tespit edilemez. Test edilecek aşı mAb-D1 ile duyarlı bir plaka içinde kuluçkaya yatırılır. Bağlı trimerik RABV glikoproteinler tekrar mAb-D1 eklenerek tanımlanır, peroksidaz ile etiketlenir ve daha sonra substrat ve kromojen varlığında ortaya çıkar. Test edilen aşı ve referans aşı için ölçülen emiciliğin karşılaştırılması immünojenik glikoprotein içeriğinin belirlenmesine olanak sağlar.
50 yıldan fazla olduğundan, NIH testi1 toplu yayından önce kuduz aşısı gücünü değerlendirmek için altın standart bir yöntem olarak kullanılır. Bu test, 14 gün sonra kuduz virüsü (RABV) türü olan Challenge Virus Standard (CVS) ile birlikte test edilecek aşı ile fare gruplarının intraperitoneal bağışıklamalarından oluşur. Potens IC meydan hayatta farelerin oranında değerlendirilir. Who2 ve Avrupa Farmakopesi3 hala aşı potens değerlendirmek için NIH testi gerektirir rağmen, Bu test çeşitli engeller uğrar: sonuçlar son derece değişken4; enfeksiyöz RABV meydan okuma sırasında kullanılır ve bu hem teknik beceri hem de sıkı biyogüvenlik önlemleri gerektirir; hayvanların çok sayıda kullanılır ve meydan şiddeti ciddi etikendişeleri5 yükseltir. Bu testin daha az ciddi bir varyasyonu geliştirilmiştir: intra-periton bağışıklama iki hafta sonra, fareler IC tarafından meydan değil ama kanama lı ve serumda spesifik RABV nötralize antikorların varlığı için test edilmiştir (VNAbs) bir in vitro nötralizasyon testi kullanarak. Ancak, bu test hala veteriner aşıları için kullanımda olmasına rağmen laboratuvar farelerin çok sayıda kurban gerektirir6,7 ve insan aşıları için kabul edilmiştir8.
Şu andan itibaren, hem Uluslararası9 hem de Avrupa10 önerisi, üreticileri ve Ulusal Kontrol Laboratuvarlarını (Official Medicine Control Laboratories – OMCLs) 3R stratejisi olarak adlandırılan laboratuvar hayvan testlerinin değiştirilmesi, azaltılması ve iyileştirilmesi konusunda teşvik etmektedir. Avrupa Direktifi 2010/63/EU (2013/01/01 yılından bu yana yürürlükte) hayvanların korunması ve refahı ile ilgili de kuduz aşılarının Kalite Kontrolü ile ilgili aşı üreticileri ve laboratuvarları için kısıtlamaları güçlendirdi yanı sıra kuduz araştırma11. Sonuç olarak, alternatif in vitro yaklaşımların geliştirilmesi, doğrulanması ve kullanımı artık bir öncelik haline gelmiştir. Bu sadece etik olarak sağlam değil, aynı zamanda toplu test maliyetlerini azaltabilir ve hafta yerine saat sonuçları için süre kısaltmak3.
RABV parçacığının yüzeyinde, glikoprotein trimerik formu benimser12,13,14,15,16. Kuduz aşısında, bu yerli trimerik form vnabs indükleyen büyük immünojen oluşturur17 ise monomerik, çözünür veya denatüre glikoproteinler kötü immünojenik18,19. Bu nedenle, aşı üretim süreci boyunca glikoprotein düzelticilerin korunması optimal immünojenik potansiyelin korunması için iyi bir göstergedir. Antikor-bağlayıcı-test20,,21, tek radyal immünodiffüzyon (SRD) testi22 ve ELISA testi23,24,,25,26,,27 gibi çeşitli immünokimyasal yöntemler, kuduz aşılarında antijen içeriğini ölçmek için WHO Teknik Rapor Serisi2 ve Avrupa monografisi3 tarafından tavsiye edilir.24 Bu aşı üretiminin tutarlılığını izlemek için üreticiler tarafından kullanılan ve OMCL tarafından insan aşıları28toplu tutarlı formülasyon değerlendirmek için, NIH testi hala potens için kabul olsa bile.
Ancak, tüm bu immünokimyasal yöntemler eşdeğer değildir. SRD testi membran demirli süsleyiciler değiştirebilir ve glikoprotein,22,29çözünür veya denatüre formu neden olabilir bir ön tedavi gerektirir. Bu nedenle, SRD bir aşı çok immünojenite kusurlu bir değerlendirme ile sonuçlanan immünojenik ve non-immünojenik glikoproteinler arasında ayrım çok verimli değildir. Buna karşılık, ELISA testi dahaduyarlıdır 22, glikoproteinin doğal yapısını korur, ve glikoprotein doğal katlanmış trimers içeriğini belirlemek için daha uygundur. ELISA testi tavşan poliklonal veya fare monoklonal anti-glikoprotein antikorları saflaştırılmış veya amonyum sülfat ile konsantre kullanabilirsiniz. Çalışmalar, NIH testi ile aşılarda ELISA tarafından değerlendirilen antijen içeriği arasında iyi bir uyum olduğunu göstermiş ve ELISA yöntemlerinin in vitro potens testi için uygun olduğu sonucuna varmıştır. Bu ELISA testleri en azından ek olabilir ya da hatta NIH testi4,26,27,30,31,32,33değiştirebilirsiniz savunucuları ., Bugün, Avrupa Farmakopesi NIH testi3alternatif olarak doğrulanmış serolojik veya immünokimyasal tahlillerin kullanılmasını önerir. Aşı potens için hayvan kullanımıtam kaçınma gerçekçi bir bakış açısı haline gelmiştir.
Aşağıda sunulan yöntem, trimerik RABV glikoprotein15,34antijenik siteleri III (aa 330-338) tanır bir fare monoklonal antikor klonu (mAb-D1) kullanarak dolaylı bir ELISA sandviç immünoyakalama dayanmaktadır. Bu yöntem başlangıçta Institut Pasteur26geliştirilmiştir ,30 sonra optimize edilmiş ve Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé tarafından doğrulandı (ANSM) laboratuvar, yani, Fransız OMCL4,33. mAb-D1 hem plakayı algılamak hem de yakalanan antijeni tespit etmek için kullanılır. Bu glikoprotein düzelticiler, yani, immünojenik RABV antijeninin spesifik niceliklenmesine olanak sağlar. Algılama için kullanılan mAb-D1 peroksidaz ile etiketlenir, hangi substrat ve kromojen varlığında ortaya çıkar. Test edilen aşı ve referans aşı için ölçülen emiciliğin karşılaştırılması immünojenik glikoprotein içeriğinin belirlenmesine olanak sağlar. RABV glikoprotein35’infarklı antijenik bölgelerini tanıyan farklı mAb’ler için aynı tip bir titreşme uygulanabileceği dikkat ivedidir. Amonyum sülfat anti-glikoprotein poliklonal tavşan immünglobulinleri G (IgG) veya monoklonal fare globulinleri elde etme ve arındırma veya konsantre etme yöntemi, peroksidaz ile antikorları bir araya getirmek için kullanılan yöntemle birlikte daha önce36 olarak açıklanmıştır37.
mAb-D1 tarafından tanınan epitop, rabv glikoproteininin antijenik bölgesi III’te yer alır ve bu sadece VNAb’lerin indüksiyonu için immündominant olmakla kalmamış, aynı zamanda nörovikurallılık, patojenite40,41 ve reseptör tanıma42’deyer almaktadır. Glikoprotein boyunca başka bir önemli antijenik site vardır, site II43, karşı birkaç MAbs mAb-WI-111235gibi izole edilmişti…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Sylvie Morgeaux ve Dr. Jean-Michel Chapsal, aşı serileri konusunda ELISA titreşmelerini oluşturmak ve uluslararası çalıştaylar ve işbirlikçi çalışmalar düzenlemek için temel katılımları için kabul edilmelidir. Sabrina Kali’ye el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Dr. Pierre Perrin mAb-D1’in izolasyon ve karakterizasyonundan sorumluydu. Bu çalışma ağırlıklı olarak Institut Pasteur finansmanı tarafından desteklenmiştir.
Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific | 10445753 | if titrating live virus |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | good for binding to the loaded antibody |
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood | ThermoFisher Scientific | 12576606 | for the preparation of sulfuric acid |
Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96 |
Dutscher | 55303 | good for binding to the loaded antibody |
Microplate Sealing Tape(100 sheets) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Microplate single mode reader Sunrise | TECAN | ||
Microplate shaker-incubator | Dutscher | 441504 | |
Microplate washer Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) | ThermoFisher Scientific | 4700880 |