Summary

Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes

Published: April 30, 2019
doi:

Summary

Nós demonstramos a cultura da único-pilha das bactérias dentro das vesículas gigantes (GVs). GVs contendo células bacterianas foram preparados pelo método de transferência de gotas e foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro para observação direta do crescimento bacteriano. Essa abordagem também pode ser adaptável a outras células.

Abstract

Nós desenvolvemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro dos vesículas gigantes (GVS). A cultura bacteriana da pilha é importante para compreender a função de pilhas bacterianas no ambiente natural. Por causa dos avanços tecnológicos, as várias funções bacterianas da pilha podem ser reveladas no nível da único-pilha dentro de um espaço confinado. Os GVs são compartimentos de microdimensões esféricos compostos por moléculas de lipídios anfífilos e podem conter vários materiais, incluindo células. Neste estudo, uma única pilha bacteriana foi encapsulada em GVs de 10 – 30 μm pelo método de transferência da gota e os GVs que contêm pilhas bacterianas foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro. Nosso método é útil para observar o crescimento em tempo real de bactérias únicas dentro de GVs. Nós cultivou pilhas de Escherichia coli (E. coli) como um modelo dentro de GVS, mas este método pode ser adaptado a outros tipos da pilha. Nosso método pode ser usado na ciência e nos campos industriais da microbiologia, da biologia, da biotecnologia, e da biologia sintética.

Introduction

A cultura de células bacterianas no nível de célula única tem recebido atenção crescente. A cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de um espaço confinado pode elucidar funções bacterianas como a variabilidade fenotípica1,2,3,4, comportamento celular5, 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9, e resistência aos antibióticos10,11. Por causa dos avanços recentes nas técnicas da cultura, a cultura de únicas bactérias pode ser conseguida dentro de um espaço confinado, como em um poço-microplaqueta4, 7,8, gota de gel12,13 , e água-em-óleo (W/s) gota5,11. Para promover a compreensão ou a utilização de únicas pilhas bacterianas, uns desenvolvimentos técnicos mais adicionais de técnicas do cultivation são necessários.

As vesículas que imitam a membrana celular biológica são compartimentos esféricos consistindo de moléculas anfífilas e podem conter vários materiais. As vesículas são classificadas de acordo com o tamanho e incluem pequenas vesículas (SVs, diâmetro < 100 nm), grandes vesículas (LVs, 1 μm). SVs ou LVs são comumente usados como portadores de drogas por causa de sua afinidade com a membrana celular biológica14. Os GVS também têm sido utilizados como um sistema de reator para a construção de protocélulas15 ou células artificiais16. O encapsulamento de células biológicas em GVS foi relatado17,18, e assim o GVS mostra potencial como um sistema de cultura celular quando combinado com o sistema de reator.

Aqui, juntamente com um vídeo de procedimentos experimentais, descrevemos como os GVs podem ser usados como novos vasos de cultura de células19. GVs contendo bactérias foram feitas pelo método de transferência de gotas20 e, em seguida, foram imobilizados em uma membrana suportada em um vidro de cobertura. Utilizamos este sistema para observar o crescimento bacteriano no nível de célula única dentro de GVs em tempo real.

Protocol

1. preparação de GVs contendo células bacterianas pelo método de transferência de gotas Prepare soluções em estoque lipídico de 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glicero-3-fosfocolina (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-SN-glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[biotinilo (polyethyleneglycol)-2000] (biotina-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) em clorofórmio/ solução de metanol (2/1, v/v) e armazene o estoque a-20 ° c. Preparação de uma solução de óleo contendo lipídios Despeje 20 μL da …

Representative Results

Apresentamos um método simples para a geração de GVs contendo células bacterianas únicas utilizando o método de transferência de gotas (Figura 1). A Figura 1a mostra uma imagem esquemática da precipitação de GVS contendo bactérias. As gotas de W/O que contêm as bactérias são transferidas através da relação da óleo-água (monolayer do lipido) pela centrifugação para dar forma a GVs. A diferença de densidade en…

Discussion

Aqui, nós descrevemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro de GVs. Este método simples envolve a formação de GVs contendo células bacterianas no nível de célula única usando o método de transferência de gotas. Comparado com outras abordagens para a obtenção de GVs contendo células bacterianas, este método tem duas vantagens: (i) é fácil de desenvolver, e (II) um pequeno volume (2 μL) da solução de amostra é necessário para preparar os GVs. O método de transfer?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma iniciativa líder para excelentes pesquisadores jovens (líder, n º 16812285) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão, um subsídio de ajuda para a pesquisa de jovens cientistas (no. 18K18157, 16K21034) da sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) a m. s., e Grant-in-Aid de MEXT a K.K. (no. 17H06417, 17H06413).

Materials

Bactotryptone BD Biosciences 211705
Chloroform Wako Pure Chemicals 032-21921
Cover glass (18 × 18 mm) Matsunami Glass Ind. C018181 thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm) Matsunami Glass Ind. custom-order thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge Hi-Tech Co. ATT101 swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) Nitoms T4613
Glass vial AS ONE 6-306-01 Durham fermentation tube
Glucose Wako Pure Chemicals 049-31165
Inverted microscope Olympus IX-73
Methanol Wako Pure Chemicals 133-16771
Microscopic heating stage system TOKAI HIT TP-110R-100
Mineral oil Nacalai Tesque 23334-85
Mini-extruder Avanti Polar Lipids 610000
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Objective lens Olympus LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes Avanti Polar Lipids 610005 pore size 100 nm
sCMOS camera Andor Zyla 4.2 plus
Sodium chloride Wako Pure Chemicals 191-01665
Sucrose Wako Pure Chemicals 196-00015
Ultrasonic bath AS ONE ASU-3D
Yeast extract BD Biosciences 212750
0.6 mL lidded plastic tube Watson 130-806C
1.5 mL lidded plastic tube Sumitomo Bakelite Co. MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline Avanti Polar Lipids 850457P POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] Avanti Polar Lipids 880129P Biotin-PEG-DSPE

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Citer Cet Article
Morita, M., Ota, Y., Katoh, K., Noda, N. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (146), e59555, doi:10.3791/59555 (2019).

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