L’analisi a livello di sistema di biomolecole multiple è fondamentale per ottenere informazioni funzionali e meccanicistiche sui processi biologici. In questo modo, viene descritto un ampio protocollo per l’estrazione ad alta produttività di lipidi, metaboliti, proteine e amido da un singolo campione raccolto dalla coltura sincronizzata di Chlamydomonas.
Le microalghe sono state al centro della ricerca per le loro applicazioni nella produzione di composti di alto valore, cibo e carburante. Inoltre, sono preziosi modelli fotosintetici che facilitano la comprensione dei processi cellulari di base. Gli studi a livello di sistema consentono una comprensione completa e approfondita delle funzioni molecolari degli organismi. Tuttavia, più campioni e protocolli indipendenti sono necessari per studi di proteomica, lipidomica e metabolomica che introducono un errore e una variabilità più elevati. Un robusto metodo di estrazione ad alta produzione per l’estrazione simultanea di clorofilla, lipidi, metaboliti, proteine e amido da un singolo campione di alga verde Chlamydomonas reinhardtii è presentato qui. La configurazione sperimentale illustrata è per le colture Chlamydomonas sincronizzate utilizzando condizioni di luce/buio di 12 h/12 h. Sono stati raccolti campioni in un ciclo cellulare di 24 h per dimostrare che i metaboliti, i lipidi e i dati dell’amido ottenuti utilizzando varie piattaforme analitiche sono ben conformi. Inoltre, sono stati utilizzati campioni di proteine raccolti utilizzando lo stesso protocollo di estrazione per condurre un’analisi proteomica dettagliata per valutarne la qualità e la riproducibilità. Sulla base dei dati, si può dedurre che il metodo illustrato fornisce un approccio robusto e riproducibile per far progredire la comprensione dei vari percorsi biochimici e delle loro funzioni con maggiore fiducia sia per la ricerca di base che per quella applicata.
Le microalghe sono una ricca fonte di prodotti naturali (ad esempio, carburanti, nutrizione umana e animale, cosmetici e sostanze farmacologiche). Numerosi sforzi di ricerca sono effettuati per migliorare l’efficienza della produzione di prodotti di alto valore da microalghe1,2,3,4. La comprensione a livello di sistemi del metabolismo è un prerequisito per migliorare la qualità e la resa dei prodotti naturali5,6,7. Con l’avvento di tecniche genomiche funzionali e migliori metodi di spettrometria di massa, migliaia di geni, trascrizioni, proteine e metaboliti possono essere monitorati contemporaneamente. Tuttavia, più campioni sono necessari per studi di proteomica approfondita, lipidomica e metabolomica, che è spesso difficile da ottenere negli organismi unicellulari, soprattutto se devono essere eseguiti studi di corsi temporali. Inoltre, la raccolta e l’elaborazione di diversi campioni in combinazione con protocolli diversi per raccogliere i dati omici altamente complessi (ad esempio, proteomica, lipomica e metabolomica) introduce variabilità, rendendo così l’integrazione dei dati un compito impegnativo.
Chlamydomonas fornisce non solo un eccellente sistema microbico per lo studio dei processi cellulari, ma anche un modello conveniente per studiare la coordinazione del ciclo cellulare e metabolismo. Di conseguenza, è stata mostrata una forte coordinazione dell’espressione delle trascrizioni con il ciclo cellulare utilizzando la profilazione trascrittoma ad alta risoluzione della coltura sincronizzata di Chlamydomonas8. Circa l’80% delle trascrizioni analizzate ha mostrato una solida periodicità su un ciclo cellulare di 24 h8. Allo stesso modo, il peso secco, le proteine, la clorofilla, gli amminoacidi e gli acidi grassi di due diversi ceppi di Chlamydomonas hanno dimostrato di correlarsi con la divisione cellulare in uno studio in cui il campionamento veniva eseguito ogni 4 h9. Recentemente, è stato riferito che la dinamica dei metaboliti e dei lipidi dello spostamento cellulare sulla base di fasi specifiche del ciclo cellulare10. I sottili cambiamenti nelle diverse biomolecole sono stati possibili monitorare utilizzando un robusto tertmetile -butyl ether (MTBE): metanolo: metodo di estrazione a base d’acqua, che offre un punto di partenza ideale per l’analisi multiomica completa10 , 11.
Il protocollo presentato guida attraverso una strategia riproducibile ed efficiente10, per l’estrazione simultanea di lipidi, metaboliti, proteine e amido da un singolo campione di aliquota, per il tempo risolto studio metabolomico e lipidomico di in crescita sincrona culture Chlamydomonas. Oltre a illustrare i dati metabolici e lipidomici robusti e riproducibili10,qui è dimostrata anche la qualità dei campioni proteomici ottenuti dallo stesso pellet.
In questo articolo, abbiamo illustrato un protocollo di estrazione robusto e altamente applicabile per linfomiche complete, metabolomica, amido e analisi proteomica da un singolo pellet di 10-15 x 106 celle. Il metodo è stato implementato con successo in diversi studi per una vasta gamma di cellule e tessuti10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Qui, abbiamo presentato una pipeline graduale per l’analisi multiomica di diverse biomolecole da un singolo campione raccolto dalla coltura Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 mt.
Il protocollo fornisce un approccio robusto e riproducibile per elaborare più campioni contemporaneamente, per l’analisi di varie biomolecole. Tuttavia, una serie di misure critiche dovrebbe essere preso cura al fine di ridurre al minimo la variazione tecnica. In primo luogo, la raccolta delle cellule dovrebbe essere fatta il più rapidamente possibile, pur mantenendo le condizioni uniformi per tutti i campioni raccolti per preservare lo stato biologico delle cellule. Anche se abbiamo usato la centrifugazione per raccogliere le cellule, strategie di raccolta alternative possono essere utilizzate per la raccolta dei campioni. Tuttavia, è importante notare che diverse strategie di raccolta sono noti per influenzare lo stato metabolico delle cellule37 quindi, approccio di raccolta coerente deve essere utilizzato per tutti i campioni sperimentali. In secondo luogo, è importante evitare l’essiccazione della fase superiore non polare contenente clorofilla, poiché ciò può influenzare i livelli di clorofilla disciolta nel solvente che influisce sul fattore di normalizzazione per i campioni. Infine, occorre prestare attenzione durante la rimozione della fase polare rimanente per ottenere la proteina e il pellet di amido, per evitare di disturbare il pellet che può influenzare il contenuto di amido e proteine.
In questo modo presentato il protocollo di estrazione offre diversi vantaggi per l’analisi dei dati multi-omica. Oltre a ridurre al minimo il numero di campioni necessari, riduce anche la variazione tra i risultati analitici ottenuti per diverse biomolecole. Ciò consente il confronto diretto dei risultati ottenuti dai metaboliti primari, dai lipidi e dai dati proteomici. Analogamente, l’estrazione simultanea di più classi composte consente una strategia di normalizzazione coerente e uniforme dei diversi set di dati. Ciò è particolarmente applicabile se la normalizzazione è difficile da ottenere utilizzando peso secco o fresco38 o numero di cellulare.
Il protocollo può essere implementato per lo screening di routine di un campione biologico complesso. Questi set di dati metabolomici, lipimmici e proteomici olistici possono offrire informazioni complete sui cambiamenti sistematici nel metabolismo. Inoltre, i dati ottenuti dall’analisi proteomica, forniscono informazioni sui cambiamenti quantitativi (abbondanza) e qualitativi (modifiche) nelle proteine in relazione ai metaboliti. Di conseguenza, l’integrazione dei dati omici potrebbe rivelare informazioni approfondite sui cambiamenti indotti dalle perturbazioni genetiche o biotiche e/o abiotiche di un sistema biologico. Così, chiarire i cambiamenti molecolari di specifiche vie metaboliche o processi cellulari. Allo stesso modo, questi dati ad alto rendimento possono consentire l’identificazione di obiettivi per l’ingegneria metabolica e perfezionare o testare le previsioni da modelli metabolici su scala genoma37,39.
The authors have nothing to disclose.
Siamo molto grati a Gudrun Wolter e a Nne Michaelis per un’eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Giavalisco per il loro aiuto. Siamo grati alla Max Planck Society per aver finanziato la ricerca e FAPESP per la borsa di studio di L A Giraldi
Reagents and standards | |||
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
Equipment | |||
1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |