Isolering och kvantitativ utvärdering av pensel celler från mus Tracheas
Summary
Pensel celler är sällsynta kolinerga kemosensoriska epitelceller som finns i den naiva mus luftstrupen. På grund av deras begränsade antal, ex vivo utvärdering av deras funktionella roll i luftvägarna immunitet och Remodeling är utmanande. Vi beskriver en metod för isolering av trakealborst celler med flödescytometri.
Abstract
Tracheal pensel celler är kolinerga kemosensoriska epitelceller redo att överföra signaler från luftvägslumen till immunförsvaret och nervsystemet. De är en del av en familj av chemosensoriska epitelceller som inkluderar tofs celler i tarmslemhinnan, pensel celler i luftstrupen, och ensamma chemosensoriska och microvillous celler i nässlemhinnan. Chemosensoriska celler i olika epiteliala fack dela viktiga intracellulära markörer och en kärna transkriptionella signatur, men också visa betydande transkriptionella heterogenitet, sannolikt reflekterande av den lokala vävnads miljön. Isolering av trakealborst celler från enstaka cellsuspensioner krävs för att definiera funktionen av dessa sällsynta epitelceller i detalj, men deras isolering är utmanande, potentiellt på grund av den nära interaktionen mellan trakealborst celler och nervändar eller på grund av luftvägsspecifika sammansättningen av snäva och anhängare korsningar. Här beskriver vi ett förfarande för isolering av pensel celler från mus trakeal epitel. Metoden är baserad på en första separation av trakeal epitel från submucosa, vilket möjliggör en efterföljande kortare inkubation av epitelial blad med papain. Detta förfarande erbjuder en snabb och bekväm lösning för flödescytometrisk sortering och funktionell analys av livskraftiga trakealborst celler.
Introduction
Pensel celler tillhör en klass av chemosensoriska epitelceller som kännetecknas av uttrycket av bitter smak receptorer och smak receptor signaltransduktion maskiner finns i smaken bud celler. Till skillnad från smak bud celler, chemosensoriska epitelceller är utspridda i epitelial ytor och kallas solitära kemosensoriska celler (SCCS) och microvillous celler i nasala epitelet1,2, pensel celler i luftstrupen 3,4, och tofs celler i tarmen5,6. Epitelceller som uttrycker bitter smak receptorer och bitter smak signaltransduktion maskiner finns också i urinröret7,8 och auditiva röret9. Luftvägarna borste celler har unika funktioner i neurogena och immun luftvägarna svar. De är acetylkolin-producerande chemosensoriska celler som framkallar skyddande respiratoriska reflexer vid aktivering med bitter föreningar och bakteriella metaboliter som kvorum-Sensing ämnen10. Luftvägarna borst celler är också den dominerande luftvägarna epitelial källa av IL-25, som reglerar aeroallergen-framkallade typ 2 inflammation i luftvägarna3.
Karakterisering av hela transkriptome av nedre luftvägarna pensel celler och deras svar på miljömässiga stimuli har begränsats av deras låga antal i trakealepitelet och mycket begränsat antal bortom den stora bronkerna10. Tekniker som används för isolering av chemosensoriska celler från tarmens epitel har inte gett proportionellt höga siffror från luftstrupen, möjligen på grund av intima kontakter luftrör pensel celler med nervändar10 eller andra vävnads-specifika faktorer i luftvägarna slemhinnan såsom sammansättningen av anhängare och snäva knutpunkt proteiner. Nyligen rapporter om framgångsrik isolering av trakealborst celler i högre antal för Single cell RNA sekvenserings analys anställd antingen en 2 h inkubation med papain eller en 18 h inkubering med pronase11,12. Eftersom längre inkuberingar med matsmältningsenzymer kan minska cellernas lönsamhet och förändra den transkriptionella profilen hos celler från smält vävnader13, detta kan bias jämförande analys med andra kemosensoriska epiteliala populationer.
Här rapporterar vi en metod för isolering av trakealborst celler för RNA-sekvensering3. Behandling av luftstrupen med hög dos dispas separerar epitelet från submucosa. Efterföljande nedbrytning av epitelial ark med papain möjliggör utmärkt återhämtning av denna strukturella cell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi fann att en kombination av hög dos dispas behandling för 40 min följt av en kort papain behandling (30 min) ger ett optimalt protokoll för trakealnedbrytning och borste cell isolering. Denna kombination undviker omfattande nedbrytning och ger den högsta avkastningen av pensel celler, jämfört med alternativa protokoll.
Medan lung nedbrytning för att extrahera hematopoietiska celler har klassiskt förlitade sig på milda matsmältningsenzymer som kollagenase IV15</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Adam Chicoine vid Brigham and Women ‘ s Human immunologi Center Flow Core för hans hjälp med Flow kors sortering. Detta arbete stöddes av nationella institut för hälso bidrag R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), och K08 AI132723 (L. G. B), och av American Academy of allergi, astma och immunologi (AAAAI)/American lung allergisk Respiratorisk sjukdom Award (N.A.B.), av AAAAI Foundation fakultet Development Award (L.G.B.), av Steven och Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), av Joycelyn C. Austen fonden för karriärutveckling av kvinnliga läkare forskare (L.G.B.), och av en generös donation av familjen Vinik (L.G.B.).
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O’Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
