마우스 기관에서 브러시 셀의 격리 및 정량 평가
Summary
브러쉬 세포는 순진한 마우스 기관에서 발견되는 희귀한 해 화학 감각 상피 세포이다. 그들의 한정된 수 때문에, 기도 면제 및 리모델링에 있는 그들의 기능적인 역할의 ex vivo 평가는 도전적입니다. 우리는 유세포에 의한 기관 브러시 세포의 격리 방법을 설명합니다.
Abstract
기관 브러쉬 세포는 면역 및 신경계에 기도 루멘에서 신호를 전송하는 태세 해 화학 감각 상피 세포입니다. 그(것)들은 장 점막에 있는 tuft 세포, 기관에 있는 브러쉬 세포, 및 비강 점막에 있는 고독한 화학 감각 및 microvillous 세포를 포함하는 화학 감각 상피 세포의 가족의 일부입니다. 상피 구획에 있는 화학 감각 세포는 중요한 세포 내 마커 및 핵심 전사 서명을 공유합니다, 그러나 또한 중요한 전사 이질성을 표시합니다, 현지 조직 환경의 가능성이 반사. 단세포 현탁액에서 기관 브러쉬 세포의 격리는 이 희소한 상피 세포의 기능을 상세히 정의하는 데 필요하지만, 기관 브러시 세포와 신경 종말 사이의 밀접한 상호 작용으로 인해 이들의 격리가 어려울 수 있습니다. 또는 단단하고 접합부의 기도 특정 조성으로 인해. 여기서, 우리는 마우스 기관 상피로부터 브러시 세포의 분리를 위한 절차를 기술한다. 이 방법은 점막에서 기관 상피의 초기 분리를 기반으로하여 파파인이있는 상피 시트의 후속 짧은 배양을 허용합니다. 이 절차는 실행 가능한 기관 브러시 세포의 유세포 측정 선별 및 기능 분석을위한 신속하고 편리한 솔루션을 제공합니다.
Introduction
브러쉬 세포는 미각 세포에서 발견되는 쓴 맛 수용체 및 미각 수용체 형질전환 기계의 발현을 특징으로 하는 화학 감각 상피 세포의 클래스에 속한다. 미각 세포와는 달리, 화학 감각 상피 세포는 상피 표면에 흩어져 있으며 비강 상피 1,2,기관내의 브러시 세포에서 독방 화학 감각 세포 (SCC) 및 마이크로 빌러스 세포라고합니다. 3,4,소장 5,6의터프 세포. 쓴 맛 수용체및 쓴 맛의 트랜스덕션 기계를 발현하는 상피 세포는또한 요도 7,8 및 청각 튜브9에서발견된다. 기도 브러쉬 세포는 신경 발생 및 면역 기도 반응에 있는 유일한 기능이 있습니다. 그들은 아세틸 콜린 생산 화학 감각 세포는 정족수 감지 물질10과 같은 쓴 화합물 및 세균 대사 산물로 활성화시 보호 호흡 반사를 불러 일으킨다. 기도 브러쉬 세포는 또한 기도 3에 있는 에어로알러겐 유도제 유도한 타입-2 염증을 통제하는IL-25의 지배적인 기도 상피 근원입니다.
하부 기도 브러쉬 세포의 전체 전사체의 특성및 환경 자극에 대한 이들의 반응은 기관상피의 낮은 수와 큰 기관지(10)를넘어서는 매우 제한된 수에 의해 제한되었다. 장 상피에서 화학 감각 세포의 격리에 사용되는 기술은 아마도 신경 종말10 또는 다른 기관 브러시 세포의 친밀한 접촉 때문에 기관에서 비례적으로 높은 숫자를 산출하지 않았습니다. 부착물 및 단단한 접합 단백질의 조성과 같은 호흡기 점막의 조직 별 인자. 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 높은 수치로 기관 브러시 세포의 성공적인 격리에 대한 최근의 보고는 파파인을 사용한 2시간 배양 또는 18시간 배양과 pronase11,12. 소화 효소를 가진 더 긴 배양은 세포 생존을 감소시키고 소화한 조직13에서세포의 전사 단면도를 바꿀 수 있기 때문에, 이것은 그밖 화학 감각 상피 인구와 비교 분석을 편향할 수 있었습니다.
여기서, 우리는 RNA 시퀀싱 3에 대한 기관 브러시 세포의격리를위한 방법을보고합니다. 고용량 디스파스로 기관을 치료하여 상피를 점막과 분리합니다. 파파인과 상피 시트의 후속 소화는이 구조 세포의 우수한 회복을 허용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 40 분 동안 고용량 디스파스 치료의 조합과 짧은 파파인 치료 (30 분)가 기관 소화 및 브러시 세포 격리를위한 최적의 프로토콜을 제공한다는 것을 발견했습니다. 이 조합은 광범위한 소화를 방지하고 대체 프로토콜에 비해 브러시 셀의 가장 높은 수율을 생성합니다.
조혈 세포를 추출하는 폐 소화는 콜라게나아제 IV15와같은 가벼운 소화 효소에 고전적…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
브리검 여성 인간 면역학 센터 플로우 코어의 아담 치코인(Adam Chicoine)에게 유동 세포 측정 분류에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), 및 K08 AI132723 (L.G.B), 및 알레르기, 천식 및 면역학의 미국 아카데미 (AAAAI)/ 미국 폐 알레르기 호흡기 질환 상 (N.A.B.), AAAI 재단 교수 개발 상 (L.G.B.), 스티븐과 주디 케이 젊은 혁신상 (N.A.B.), 여성 의사 과학자의 경력 개발을위한 조이셀린 C. 오스틴 기금에 의해 (L.G.B.), 그리고 에 의해 비닉 가족(L.G.B.)의 후원금 기부.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
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