流式细胞术测定小鼠胸腺、胰腺干淋巴结和脾脏的调节 t 细胞亚群
Summary
在此, 我们提出了一个方案, 以准备单细胞从小鼠胸腺, 胰腺引流淋巴结和脾脏, 进一步研究这些细胞使用流式细胞仪。此外, 该协议还用于使用流式细胞仪确定调节 t 细胞的子集。
Abstract
我们的免疫系统由多种免疫细胞组成, 包括调节 t 细胞 (treg)。树状细胞可分为胸腺衍生的特雷格 (treg) 细胞和外周诱导的 treg (treg) 细胞。它们存在于我们身体的不同器官中, 可以通过特定的标记来区分, 如 helios 和 neuspilin 1。据报道, ttreg 细胞在功能上比 ptreg 细胞更具有抑制作用。因此, 在研究异质细胞群时, 确定 ttreg 和 ptreg 细胞的比例是很重要的。在此, 我们收集胸腺腺体, 胰腺引流淋巴结和脾脏从正常血糖非肥胖糖尿病小鼠, 以区分 ttreg 细胞和皮纹细胞流式细胞检查。我们手动准备了这些器官的单个细胞悬浮液。采用氟铬共轭表面 cd4、cd8、cd25 和神经皮素1抗体对细胞进行染色。他们被关押在冰箱里过夜。第二天, 细胞被污染的氟铬共轭细胞内 fffp3 和 helios 抗体。这些标记被用来描述特雷格细胞的两个子集。该方案演示了一种简单而实用的方法来制备来自小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏的单细胞, 并将其用于随后的流式细胞仪分析。
Introduction
调节 t (treg) 细胞对免疫系统的稳态是至关重要的。树状细胞是由表面抗原 cd4 和 cd25 的表达和转录因子叉头盒 p3 (foxp3)1,2,3的表达定义的。sakaguchi 等人首先表明, cd25 在小鼠4的 t 抑制细胞上有本构表达, 为人类树状细胞的鉴定提供了开拓性的观察。树状细胞在免疫耐受中发挥着核心作用, 通过各种机制施加抑制能力, 包括通过分泌粒酶进行细胞分裂, 诱导细胞凋亡, 细胞因子消耗和抑制通过细胞毒性的表达t 淋巴细胞抗原 45。此外, 它们还能分泌抑制细胞因子, 如转化生长因子β (tgf-β)、白细胞介素-10 (il-10) 和 il-355。树状细胞可以自然地从胸腺中提取, 在这种情况下, 它们被指定为胸腺衍生的 treg (treg) 细胞, 或者它们可以在外周器官中诱导, 在这种情况下被称为外周诱导的 treg (ptreg) 细胞。
helios 是 icaros 转录因子家族的成员, 据报道, 他是区分 ttreg 细胞和 ptreg 细胞6的标志。后来, 另外两个组报告说, 神经皮素 1 (nrp1), 一个信号素 iii 受体, 可以作为 ttreg 细胞的表面标记在一定条件下7,8。然而, singh 等人已经表明, 在这种情况下, helios 是一个更好的标记在天真的老鼠9。
特雷格细胞的亚群在维持免疫系统的稳态和防止自身免疫和感染方面发挥着关键作用。因此, 重要的是要确定这些人群在淋巴组织和非淋巴组织中的数量和比例。要做到这一点, 就必须准备从这些器官中获得单细胞悬浮液。在以前的研究中描述或使用了一些协议。主要是在以前发表的报告10、11 中使用了自动分离器。使用自动解拿是方便和节省时间, 但它是一个昂贵的程序。因此, 我们使用人工方法制备单细胞悬浮液从小鼠胸腺, 胰腺引流淋巴结 (pdln) 和脾脏从正常血糖非肥胖糖尿病 (nod) 小鼠, 以及从这些器官孤立的单个细胞。该方法已在以往的研究中得到应用, 我们发现人工制备单细胞悬浮液的方法与自动分离器方法9、12、13、14一样有效。此外, 我们使用流式细胞仪来确定 cd4+cd8-cd25 + fffp3+ treg 细胞的比例以及 treg 细胞 ttreg 和 treg 细胞的子集.利用 helios 和 nrp1 作为 ttreg 细胞的标记, 对 ttreg 和 treg 细胞进行了区分。因此, 我们的研究结果表明, 制备单细胞的人工方法确实有效地工作, 制备的单细胞悬浮液可进一步用于流式细胞仪的研究。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本研究中, 我们从 nod 小鼠胸腺、pdln 和脾脏中分离出单个细胞, 并利用流式细胞仪研究 cd4 + cd8-cd25 + Nrp1+treg 细胞中 helios 和 nrp1的表达.在本研究中, 使用了 nod 小鼠, 这是1型糖尿病的小鼠模型。在之前的一项研究中, 我们使用野生型小鼠株 cd-1 和 c57bl6 小鼠来研究 helios 或 nrp1 是否是区分 ttreg 细胞和 ptreg 细胞的更好标记。在这项研究中, 我们使用了类似的协议来确?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究报告得到瑞典研究理事会、exodiab、瑞典糖尿病基金会、瑞典儿童糖尿病基金、seb diabetesfonden 和 o. e. och edla johansson vetenskapliga stiftelse 的资助。作者还要感谢 per-o拉·卡尔松和 stellan sandler 的支持和讨论。
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes–possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
