우리는 뇌 조직의 전자 현미경 조사에 대 한 새로운 워크플로 소개합니다. 메서드를 사용 하면 편견된 패션에 신경 기능 검사를 수 있습니다. 원소 분석, 우리는 또한 automatizes 대부분의 무작위 샘플링에 대 한 워크플로 스크립트 제시.
전자 현미경 검사 법으로 신경 및 그들의 시 냅 스의 ultrastructural 기능에 대 한 조사만 있습니다. 특히 밀도 변화의 비교 연구와 같은 특징의 배포판에 대 한 편견된 샘플링 프로토콜 신뢰할 수 있는 결과 대 한 생명 이다. 여기, 우리는 뇌 샘플 이미지 수집에 대 한 워크플로 제시. 워크플로 정의 된 뇌 영역 내에서 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링을 허용 하 고는 disector를 사용 하 여 이미지를 분석할 수 있습니다. 이 기술은 직렬 섹션의 광범위 한 검사 보다 훨씬 빠릅니다 하지만 여전히 밀도 그리고 열 대권 외의 특징의 분포를 추정 하는 가능한 접근을 선물 한다. 포함, 전에 얼룩진된 vibratome 섹션 두뇌 지역 조사, 전체 견본 준비는 도움이 속도 처리를 식별 하는 참조로 사용 되었다. 이 이렇게 쥐의 뇌에서 여러 매개 변수를 ultrastructural에 농축 주택 환경의 효과 조사 하 고 비교 연구를 위해 사용 되었다. 워크플로의 성공적인 사용에 따라, 우리 뇌 샘플의 원소 분석을 목적으로 적응. 우리는 사용자 상호 작용의 시간 프로토콜 최적화. SerialEM 오픈 소스 소프트웨어에 대 한 스크립트를 컴파일하여 모든 시간이 많이 걸리는 단계를 자동화 원소 지도 취득의 주요 작업에 초점을 사용자를 수 있습니다. 원래 워크플로로 우리는 신뢰할 수 있는 결과 편견된 샘플링 방식에 관심을 지불.
전자 현미경에서 그것은 종종 샘플 섹션에서 대표적인 지역 도전입니다. 우리는, 관찰자로 종종 편견 샘플의 눈에 띄는 기능에 의해 우리의 주의에 그려진 특정 지역에서 보고 잘 분산, 편견 샘플링을 방지. 샘플링 바이어스만 피할 수 있습니다 관심 영역의 전자 현미경 사진1에 결말의 동일한 기회가 되 면. 그것은 무대 중지 어디 샘플링 영역 선택 되므로 이미지를 보고 하지 않고 수동으로 현미경의 트랙볼을 누르면 예를 들어 소프트웨어 솔루션 없이 샘플링 바이어스를 피하기 위해 수 있습니다. 그러나 엄밀히 말하면, 이건 임의의 절차 때문에, 의식적으로 또는 무의식적으로, 사용자는 무대의 움직임에 영향을 가질 수 있습니다, 또한,이 샘플링 영역을 선택 하는 정교한 방법이 아니다. 무작위 샘플링 섹션의 쌍 stereology1, 섹션, 알려진된 거리 떨어져의 쌍을 필요로 하는 특정 볼륨에서 예를 들어 구조 수를 평가 하기 위해 사용 하는 경우에 특히 중요 해 집니다. 그것은 또한 수만 단일 섹션을 특정 구조2의 수를 예상 하지만이 방법을 조사 하는 경향이 더 큰 구조의 수 밀도과 대 평가 구조는 매우 작은 하지 않는 한 섹션 두께 비교입니다. 대체 방법을 직렬 섹션에서 조직의 볼륨을 재구성 하 고 따라서3원하는 데이터 얻을 수 있습니다. 그러나 이것은 매우 시간이 소모 하 고 (더 큰) 비교 연구에 대 한 실현 가능한 접근 하지.
이러한 문제를 해결 하려면 워크플로를 자동으로 울트라 얇은 섹션에서 정기적인 간격에 전자 현미경을 얻기 위해 샘플 선택 연구원 수를 개발 했습니다. 전자 현미경의 위치는 임의 편견된 샘플링을 허용. 방식은 적당 한 구조 (예를 들어 시 냅 스는 특정 neuropil 볼륨4,5에서)의 수 밀도 구조 기능 (예를 들어 폭 시 냅 스 갈라진 틈의 크기를 결정 하기 위한 두 또는 postsynaptic 밀도4,5의 직경).
워크플로 샘플링 (RPS) 소프트웨어 (우리의 현미경와 함께 제공 되는 스크립팅 소프트웨어를 사용 하 여 자바 스크립트에서 작성 된) 울트라 얇은 섹션의 미리 정의 된 영역 내에서 격자 위치를 자동으로 계산 하는 주문 품 임의의 포인트를 사용 합니다. RPS 소프트웨어 전자 현미경 사진 각 지점에서 만들 수 있도록 이러한 미리 정의 된 포인트, 전자 현미경의 스테이지를 이동 합니다. 먼저, 사용자는 얇은 섹션 내에서 관심 영역을 정의합니다. 다음, RPS 소프트웨어는이 지역 내의 격자 위치를 계산합니다. X / y 좌표는 첫 번째 위치 무작위로, 생성 되 고 나머지 위치 일반 그리드 간격 첫 번째 위치에 배치 됩니다. 관심 영역의 모든 부분 검사를 받고 동일한 기회를가지고, 때문에 최소한의 데이터 수집을 수 있습니다. 샘플링의이 이렇게 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링 라고도 (참조 대 한 자세한 내용은6,7 참조).
구조의 숫자 밀도 결정, 우리는 알려진된 거리 떨어져의 쌍 작동 합니다. 미리 결정 된 위치 중 하나에서 첫 번째 섹션에서 전자 현미경 사진 후, 가장 직렬 섹션 소프트웨어 (우리의 전자 현미경과 함께 제공 된 소프트웨어 패키지의 일부)에 두 번째 섹션의 해당 위치로 이동 전자 현미경 사진의 해당 위치를 가져옵니다. 이것은 미리 결정 된 격자에 모든 위치에 대해 반복 됩니다. 우리의 접근 방법에는 disector는 전자 현미경8,9의 각 쌍에 있는 입자의 수를 계산 하는 데 사용 됩니다. 각 섹션8,9한 계산 프레임의 쌍을 disector에 의하여 이루어져 있다. 개체의 숫자 밀도 표시 개체를 계산 하 여 결정 되는 첫 번째 섹션 (또는 참조 섹션)에 두 번째 섹션 (또는 조회 섹션). 이 신속 하 고 효율적인 방법으로8,9에 있는 개체의 숫자 밀도 추정 수 있습니다. 또한 단일 섹션에 2 차원 구조 기능 측정 될 수 있다.
우리는이 워크플로 조건 표준 환경 (SE) 조건4,5, 주택에 비해 주택 농축된 환경 (EE)에 노출 된 쥐의 해 마에서 시 냅 스 숫자에서 차이 평가를 성공적으로 적용 그리고 또한 야생 타입 (WT) 마우스와 neuropeptide Y (NPY) 코 쥐 ultrastructural 차이 평가 하기 위해 SE 및 EE5에서 보관. 우리의 목표 보고 했다 특히 숫자 시 냅 스 밀도 같은 뉴런의 구조 기능 활성 영역 횡단면에서의 postsynaptic 밀도, 시 냅 스 갈라진 틈, 그리고 시 냅 스 소포 수의 폭의 길이 위해 신경 연결 및 활성화 다른 실험 조건 사이 변화를 평가 합니다. 또한, 우리는 특정 뇌 영역에 저장 된 neuropeptides의 양을 결정 하는 뉴런에 조밀한 코어 소포 (DCV)의 숫자 밀도에 관심이 있었다.
우리의 다음 단계에서 설명한 연구에 대 한 우리의 접근 방법의 성공에 따라 우리 인간의 두뇌 샘플 내 편견된 원소 분석에 대 한 영역을 선택 하려면 우리의 워크플로 적응 했습니다. 이 ferritin 분자 신경 그리고 glial 세포에에서 저장 되어 있는 이미지 철 위해서입니다. 이 위해, 우리 뇌 섹션 정의 된 영역에서의 임의의 심사 과정에 대 한 작업의 대부분을 자동화 하는 스크립트 컴파일.
여기에 제시 된 워크플로 연구원을 ultrastructural 기능 편견된 패션에 데이터를 얻을 수 있습니다. 이것은 직렬 섹션에서 볼륨 조사 보다 훨씬 적은 시간이 소요입니다. 여러 다른 응용 프로그램은이 목표를 달성 하는 데 사용 됩니다. 처음에, 우리의 주문 품 RPS 소프트웨어 (가용성에 대 한 내용은 해당 저자를 문의 하시기 바랍니다)에 대 한 사용 됩니다 샘플링 영역 좌표를 선택 하 임의 단계 변화를 소개 하. 투자 수익의 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링 수 있습니다. 다음, 특정 구조 계산, 우리가 적응, 우리 이전 연구13,,1415 에 비해 소설 방식에서, 알려진 거리 2 연속 섹션 비교는 disector 메서드를 우리의 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링에 대 한 주문 품 RPS 소프트웨어입니다. 이 직렬 섹션에서 전체 볼륨 3 차원 재구성에 비교 하 여 시간이 절약 됩니다. 맞춤 RPS 소프트웨어는 한 가지 유형의 워크플로 재현에 대 한 제한 요소는 현미경에 대 한 구체적으로 개발 된다. 이 특정 소프트웨어에서 대안 스크립팅 허용 하 고 다른 현미경 모델에 호환 되는 응용 프로그램 것입니다.
우리는 성공적으로 우리의 비교 연구4,5에 대 한이 접근을 사용합니다. 울트라 얇은 부분의 신경 조직, 관심 영역 설명 했다 고 사진이이 지역 내의 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링에 의해 촬영 되었다. 그것은 관심가 이랑의 변이 레이어 영역 오히려 작은 지역 조사는 우리의 접근 방법에 대 한 도움이 될 수 있다 있다. 무작위로 배치 disector 내에서 우리 DCV의 수를 평가 하 고 성인 쥐의 DGpl에서 시 냅 스의 여러 가지 ultrastructural 기능 성인 NPY 녹아웃 마우스 대 마우스 SE와 EE 뿐만 아니라 성인 WT에 보관 합니다. 우리의 접근 방식을 사용 하 여, 수집 된 데이터 조사 매개 변수 중 일부에 변화를 보여주었다. 이러한 연구 결과 청소년 동물2다른 유사한 연구에서 사람을 확인 했다.
이 워크플로의 실험 사용의 단점은이 다중 응용 프로그램 응용 프로그램 접근 하지 이상적입니다, 사용자 편의성 측면에서 사용자 (우리의 경우, 사용자 인터페이스, 가장 직렬 섹션에서에서 다른 사용자 인터페이스와 함께 편안 하 게 필요가 있을 RPS 소프트웨어 및 SerialEM 소프트웨어). 효율적인 방법으로 모든 응용 프로그램을 처리 하기 위해 학습 시간이 소요 하 고 고려 되어야 한다. 그러나,이 워크플로 사용 하 여 학습에 시간을 투자는 여전히 명확 하 게 유리한 직렬 섹션 가장 전체 볼륨을 분석 하는 데 필요한 시간 동안. 관심 분야에서 체계적인 획 일 한 무작위 샘플링에 의해 배치 하는 disector를 사용 하 여의 방법은 섹션/볼륨의 높은 금액을 조사 하는 필요 없이 신뢰할 수 있는 데이터1 을 제시 하는 충분 한 이다.
우리의 연구 결과 최대화 하기 위해 그것은 샘플 준비 하는 동안 잘 돌 중요 한 조직과 구조 보존만 관심의 영역을 명확 하 게 식별 하는 데 뿐만 아니라 구조 기능을 평가 하기 위한 중요 하지 않습니다. 중추적인 요소, 그리고 아마도 또 다른 단점은이 방법의 초박형 섹션 쌍의 고품질 필요 하다는 것 이다: 아무 구멍 또는 주름을 조사 섹션 중 하나에서 영역을 커버 해야 하며 섹션 두께 이어야 균질 유지. 연구원은 ultramicrotomy에서 숙련 되어야 합니다. 케어 섹션 전자 빔 손상에 민감한 고 쉽게 떨어져 찢을 수 있다, 가장에 섹션을 이미징 하는 경우에 또한 있다. 또한, 그것은 투자 수익에 샘플링 영역의 오른쪽 숫자를 선택 하는 것이 중요입니다. 실험 목적에 따라 전자 현미경의 확대는 신중 하 게 설정할 수 있다. 우리의 실험에 대 한 특히, 중앙 신경에 시 냅 스를 계산 20 한 구역에 대 한 관심의 30.25 µ m2 의 영역으로는 최적의. 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 문제의 (우리의 경우 시 냅 스, 시 냅 스 기능 및 DCV) 기능을 인식에서 직원을 훈련 하는 것이 좋습니다. 시 냅 스를 식별, 시 냅 스 소포 식별 해야 하며이 적어도 10의 해상도 nm. 이 위해, 5000 X의 확대 최적의 했지만 배율을 하드웨어 매개 종류와 카메라의 위치에 따라 달라 집니다 그리고 다른 현미경 및 카메라 유형에 대 한 적응 시킬 필요가 있을 것입니다 지적 하는. 그것은 또한 지적 한 가장에 대 한 응용 프로그램 특정 프로토콜에 사용 하는 다른 모델 사용자 설정에서 차이 고려해 야 하는 있다.
우리는 우리의 워크플로 적응 시킬 수 있다 신경 과학 뿐만 아니라 생물 과학 및 재료 과학의 넓은 분야에 많은 다른 응용을 위해 (해당 되는 경우에 가장 높은 해상도 필요) 체계적인 제복을 요구 하는 연구 질문 때마다 믿습니다. 무작위 샘플링 및 검사 샘플의 분석의 시간 효율적인 방법으로 요구 한다. 예를 들어 우리는 현재 인간 두뇌에 철 매장 지역화 관심이 있습니다. 이 위해, 우리 최근 우리의 워크플로, 임의로 선택 된 영역에 울트라 얇은 섹션에 원소 분석를 적응 시켰다. 워크플로에 필요한 응용 프로그램의 수를 최소화 하기 위해 우리가 있기 때문에 미리 포인트를 설정 임의의 방식으로 선택할 수 있는 무대를 이동 하도록 프로그래밍할 수 있습니다만, SerialEM 소프트웨어를 사용 하 여 적용 목적입니다. 사용자 지정된 스크립트 워크플로 전적으로 자동화의 목표와 더불어 가장 제어를 만들었습니다. 이 만족 스러운 결과 얻을 하지 않았다 필터링 된 이미징 모드에서는 autofocusing 제외 가능한 입증 했다. 우리는 따라서 초점을 위한 고 에너지 필터링 된 이미지를 얻기 위해 DM 소프트웨어 사용.
요약 하자면, 우리는 편견 방식에서 전자 현미경을 얻는 데 도움이 소프트웨어 솔루션 제시.
The authors have nothing to disclose.
오스트리아 과학 기금, FWF, 프로젝트 번호 P 29370 B27에 의해 자금
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |