Мы представляем Роман рабочего процесса для электронной микроскопии исследования мозговой ткани. Этот метод позволяет пользователю для изучения нейрональных функции в непредвзятой манере. Для элементного анализа мы также представляем сценарий, который автоматизирует большую часть рабочего процесса для рандомизированные выборки.
Исследования ультраструктурные особенности нейронов и их синапсы возможны только с электронной микроскопии. Особенно для сравнительных исследований изменения в плотности и распределения таких функций протокол беспристрастной выборки жизненно важное значение для достижения надежных результатов. Здесь мы представляем рабочий процесс для захвата изображений образцов мозга. Рабочий процесс позволяет систематический единообразные случайной выборки в области определенных мозга, и изображения могут быть проанализированы с помощью disector. Этот метод гораздо быстрее, чем обширные изучения последовательных секций, но по-прежнему представляет целесообразный подход для оценки плотности и распределения Ультраструктура функций. До внедрения, окрашенных vibratome разделы были использованы как ссылку для определения области мозга под следствием, который помог ускорить подготовку общего образца процесса. Этот подход был использован для сравнительных исследований, влияние обогащенный жилищных условий на нескольких ультраструктурных параметров в мозг мыши. Опираясь на успешное использование рабочего процесса, мы адаптировали его для элементного анализа образцов мозга. Мы оптимизировали протокола с точки зрения времени взаимодействия с пользователем. Автоматизация всех времени шаги путем компиляции сценария для с открытым исходным кодом SerialEM помогает пользователю сосредоточиться на основной работе получения элементарного карты. Как и исходный рабочий процесс мы обратили внимание на беспристрастной выборки подход к гарантировать надежные результаты.
В электронной микроскопии часто бывает сложно образец представитель регионов в рамках разделов. Мы, в качестве наблюдателя, часто смещены взглянуть на конкретные регионы, обращено наше внимание заметных особенностей образца, предотвращая хорошо распределенных, беспристрастной выборки. Смещения выборки можно избежать только если каждый частью региона интерес получает такой же шанс оказаться в электронная микрофотография1. Это позволяет избежать смещения выборки без программное решение, например, нажав trackball микроскопа вручную не глядя на изображение, чтобы выбрать выборки регионах где перестанет сцене. Но, строго говоря, это не случайная процедура, потому что, сознательно или подсознательно, пользователь может иметь влияние на движение сцены, и, Кроме того, это не сложный способ отбора проб регионов. Случайная выборка становится особенно важным, если пары разделов используются для оценки числа структур в определенном объеме, например, для stereology1, который требует пары разделов, известный расстоянии друг от друга. Также можно смотреть только в одну секцию и оценить количество конкретных структур2, но с этим подходом следователи склонны переоценивать численный плотность более крупные структуры, если структуры очень малы по Сравнение толщины среза. Альтернативные подходы, для восстановления томов ткани от последовательных секций и таким образом получить желаемых данных3. Но это очень много времени и не целесообразный подход (больше) сравнительных исследований.
Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали рабочий процесс, который позволяет исследователю автоматически выбрать образцы для получения электронной микроскопии на регулярные интервалы в ультра-тонких секций. Положение электрона микроскопии случайных, позволяя беспристрастной выборки. Этот подход подходит как для определения числовых плотности структур (например, синапсы в течение определенного Нейропиль тома4,5) и размеры структурных особенностей (например, ширина синаптическую щель, или диаметр постсинаптических плотность4,5).
Рабочий процесс использует заказные случайную точку выборки (RPS) программное обеспечение (написана на языке Java script, используя сценарии программное обеспечение, поставляемое с нашими микроскопа), которая автоматически вычисляет сетки позиции в рамках предопределенных региона интерес в ультра-тонкий секции. Программное обеспечение RPS перемещает Этап микроскопа эти предопределенные точки, так что электронная микрофотография могут быть сделаны в каждой точке. Во-первых пользователь определяет область интереса в тонкие секции. Далее RPS программное обеспечение вычисляет сетки позиции в этом регионе. X / y координаты первой позиции создаются случайным образом, и оставшиеся должности размещены промежутки регулярной сетки в отношении в первую позицию. Потому что каждый частью региона интерес имеет такой же шанс рассматривается, это позволяет коллекции минимальный объем данных. Этот подход выборки также называется систематический единообразные случайной выборки (см. ссылки7 6,для получения более подробной информации).
Для определения числовых плотности структуры, мы работаем с пары разделов, которые являются известными расстоянии друг от друга. После получения электронная микрофотография из первого раздела в одной из заранее определенных позиций, ТЕА серийный раздел программного обеспечения (часть пакета программного обеспечения поставляется с нашими микроскопа) движется к соответствующей точке во втором разделе, для того чтобы получите электронная микрофотография соответствующего местоположения. Это повторяется для каждого местоположения в сетке заранее. В нашем подходе disector используется для подсчета числа частиц в каждой паре электронной микроскопии8,9. Disector состоит из пары учет кадров, один для каждого раздела8,9. Численное плотность объектов определяется только подсчет объекты видны на первый раздел (или справочный раздел), но не на второй раздел (или раздел поиска). Это позволяет оценить численные плотности объектов в быстрый и эффективный способ8,9. Кроме того на одной секции, двумерных структурные особенности могут быть измерены.
Мы применили этот процесс успешно для оценки различий в числа синапсов в гиппокампе мышей в жилищных условий по сравнению с обычной среде (SE) жилищных условий4,5, обогащенный окружающей среды (EE) а также для оценки ультраструктурных различия между дикого типа (WT) мышах и нейропептида Y (NPY) KO мышей держали под SE и EE5. Нашей целью было смотреть специально на структурных особенностей нейронов, как численные синаптических плотность, длины активной зоны в сечениях и постсинаптических плотности, ширина синаптическую щель и количество синаптических пузырьков, для того, чтобы оценить изменения в нейрональных подключения и активации между различных экспериментальных условиях. Кроме того мы были заинтересованы в численные плотность плотные ядра везикулы (DCV) в нейронах определить количество хранимых нейропептидов в определенной области мозга.
Основываясь на успехе нашего подхода для проведения исследований, описанных выше, в наш следующий шаг, мы адаптировали наш рабочий процесс для выбора областей для беспристрастной элементного анализа в рамках образцы человеческого мозга. Это было сделано для изображения железа, который хранится в молекулах ферритина в нейронов и глиальных клеток. Для этого мы составили скрипт, который позволил нам автоматизировать большинство операций для случайного отбора участков мозга в определенной области.
Исследователя для получения данных на ультраструктурные функции в непредвзятой манере позволяет рабочий процесс, представленные здесь. Это гораздо меньше времени, чем объем расследований из последовательных секций. Для достижения этой цели используются несколько различных приложений. Во-первых наше программное обеспечение на заказ RPS (для подробной информации о доступности, обращайтесь соответствующий автор) используется для ввести случайные этап shift, чтобы выбрать координаты области выборки. Это позволяет систематический единообразные случайной выборки ROI. Далее, для подсчета конкретных структур, мы адаптировали метод disector, где сравниваются 2 последовательных секций с известным расстоянием, Роман способом, по сравнению с предыдущих исследований13,14,15 , как мы использовали наш RPS специализированного программного обеспечения для систематический единообразные случайной выборки. Это экономит время по сравнению с 3D-реконструкции всего тома из последовательных секций. RPS программного обеспечения по индивидуальному заказу специально разработана для одного типа микроскопа, который является ограничивающим фактором для воспроизведения рабочего процесса. Альтернативой от этого конкретного программного обеспечения будет приложение, которое позволяет сценариев и совместимо с другими моделями микроскопа.
Мы успешно использовать этот подход для наших сравнительных исследований4,5. На ультра-тонких секций нейронной ткани изложенные области интересов и изображения были взяты систематический единообразные случайной выборки в этой области. Стоит отметить, что сфера интересов, превращение слое зубчатой извилины, является довольно небольшой площади для расследования, которые могут быть полезны для нашего подхода. В рамках случайно помещены disector мы оценивали количество DCV и несколько ультраструктурные особенности синапсов в DGpl взрослых мышей размещается в SE и EE, а также взрослых WT мышей против взрослых мышей NPY нокаут. Используя наш подход, собранные данные показали изменения в некоторых из исследуемых параметров. Эти выводы подтверждают те из других аналогичных исследований в отношении несовершеннолетних животных2.
Недостаток использования экспериментальной этого рабочего процесса может быть что это multi распыления подход не является идеальным с точки зрения удобства для пользователей, как пользователям нужно получить комфортно с различных интерфейсов (в нашем случае, Пользовательский интерфейс, ТЕА серийный секции RPS программного обеспечения и программного обеспечения SerialEM). Обучение для обработки всех приложений в эффективный способ много времени и должны быть приняты во внимание. Однако инвестировать время в научиться использовать этот рабочий процесс по-прежнему явно благоприятные во времени, которая необходима для анализа всего тома с последовательным секции ТЕА. Метод с использованием disector, размещенных систематический единообразные случайной выборки в области интересов достаточно представить достоверных данных1 без необходимости расследовать большое количество секций/тома.
Чтобы максимизировать результаты в наших исследованиях, жизненно важно принять хороший уход во время подготовки проб, как сохранение тканей и структур важно не только для оценки структурных особенностей, но и для определения области интересов однозначно. Решающим фактором и возможно еще один недостаток этого метода, является то, что высокое качество ультра-тонких секций пар требуется: там должно быть без отверстий или морщины, которые покрывают площадь под расследование в любой из разделов, и толщина среза должна быть поддерживал однородной. Исследователь должен быть хорошо подготовленных в ultramicrotomy. Уход за должно также приниматься при визуализации в подразделах ТЕА, как разделы чувствительны к электронно пучка повреждений и может легко разорвать. Кроме того важно выбрать правильный количество проб областей в ROI. В зависимости от экспериментальной целью увеличение микроскопии электрон должен быть установлен тщательно. Для наших экспериментов конкретно, считая синапсов в центральной нервной системе, 20 регионов интерес на одном участке площадью 30.25 мкм2 являются оптимальными. Рекомендуется для подготовки персонала в признавая особенности в вопросе (в нашем случае синапсы, синаптических особенности и DCV), чтобы получить надежные результаты. С целью выявления синапсы, синаптических пузырьков должны быть идентифицированы, и это требует резолюция по крайней мере 10 Нм. Для этого увеличение 5000 X была оптимальной, но он должен отметить, что масштаб зависит от аппаратных параметров, таких как тип и положение камеры и должны быть адаптированы для других типов микроскопа и/или камеры. Она также имеет следует отметить, что протокол использует приложений, специфичных для одного ТЕА и у пользователей с другими моделями рассмотреть различия в настройке.
Мы считаем, что наш рабочий процесс можно адаптировать для многих других приложений, не только в неврологии, но и в широком поле биологической науки, а также материальная наука (когда требуется высокое разрешение ТЕА) всякий раз, когда вопрос исследования требует систематической форме случайная выборка и количество образцов быть расмотренным просит время эффективный способ анализа. Например мы в настоящее время заинтересованы в локализации запасы железа в человеческом мозге. Для этого недавно мы адаптировали наши рабочего процесса, для элементного анализа на ультра-тонких секций в произвольно выбранных районах. Для того, чтобы свести к минимуму количество приложений, которые необходимы для рабочего процесса, мы стремились применить с помощью программного обеспечения SerialEM только, потому что он может быть запрограммирован для перемещения на сцену, чтобы предустановленных точек, которые могут быть выбраны случайным образом. Мы создали пользовательские сценарии для управления ТЕА, с целью автоматизирующие процесс полностью. Это оказалось возможным за исключением автофокусировки в отфильтрованного изображения режиме, который не дают удовлетворительные результаты. Мы таким образом использовал DM программное обеспечение для фокусировки и для получения энергии фильтрация изображений.
Таким образом мы представляем программные решения, которые помогают в получении электронной микроскопии в объективной форме.
The authors have nothing to disclose.
Финансируется номер проекта Австрийский фонд науки, FWF, P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |