脳組織の電子顕微鏡による調査のための斬新なワークフローを紹介します。メソッドでは、公平な方法で神経機能を調べることができます。元素分析は、ランダム サンプリングのワークフローのほとんどを自動化スクリプトを述べる。
ニューロンとそのシナプスの微細構造の機能の調査のみ電子顕微鏡観察で可能です。特にため、このような特徴量の分布密度の変化の比較研究、公平なサンプリング プロトコルは、信頼性の高い結果に不可欠です。脳のサンプル画像の獲得のためのワークフローを紹介します。ワークフローが定義されている脳領域内で体系的な均等にランダム サンプリングを可能にし、disector を使用して画像を分析することができます。この手法は連続切片の広範な検査よりもはるかに高速ですが、まだ密度と微細構造の特徴量の分布を推定する実現可能なアプローチを提示します。埋め込み、前にステンド グラス vibratome セクションは調査、全体的な試料準備を助けた速度の処理中の脳の領域を識別するために参照として使用されました。このアプローチは、マウス脳におけるいくつかの微細構造パラメーターで濃縮住宅環境の効果を調査し、比較研究のために使用されました。脳試料の元素分析を目的として適応したワークフローの使用の成功に基づいて、我々。我々 はユーザーとの対話の時間の面でプロトコルを最適化されています。オープン ソース ソフトウェア SerialEM 用のスクリプトをコンパイルすることによってすべての時間のかかる手順を自動化することにより、元素マップを取得の主な仕事に集中するユーザー。元のワークフローと同様に、信頼性の高い結果を保証する公平なサンプリング アプローチに着目。
電子顕微鏡のサンプル セクション内の代表的な領域への挑戦です。、、オブザーバーとしてしばしば偏っているサンプルでは、顕著な特徴によって私達の注意に描かれた特定の地域を見ても分散、公平なサンプリングを防止します。関心領域のすべての部分は、電子顕微鏡写真1で終わるのと同じチャンスを取得する場合、サンプリング バイアスを回避のみことができます。どこにステージを停止、サンプリング領域を選択するために、画像を見もせず手動で顕微鏡のトラック ボールを押すことによってソフトウェア ソリューションなしサンプリング バイアスを避けるために不可能です。厳密に言えば、これは意識的にあるいは無意識のうちに、ユーザーは、ステージの動きに影響を持つことができ、また、これはサンプリング領域を選択するの洗練された方法ではありませんので、ランダムなプロシージャではありません。ランダム サンプリングはステレオロジー1セクション、離れた既知の距離のペアを必要とするため、ある特定の容積、たとえば、構造体の数を評価するためにセクションの組み合わせを使用する場合に特に重要になります。構造が非常に小さい場合を除きのより大きい構造の分布密度を過大評価する捜査官アプローチではこの傾向しますが、また 1 つのセクションだけを見るし、特定の構造2の数を推定することが可能になります。切片厚を比較。別のアプローチは、連続切片から組織のボリュームを再構築し、従って目的のデータ3を得るが。しかし、これは非常に時間がかかり、(大きい) の比較研究可能なアプローチしません。
これらの問題を克服するためには、超薄切片内で定期的な間隔で電子顕微鏡写真を取得するためのサンプルを自動的に選択する研究者を可能にするワークフローを開発しました。電子顕微鏡写真の位置はランダムで、公平なサンプリングを可能です。アプローチが適して両方の構造 (たとえば、ある神経ボリューム4,5内シナプス) の数値の密度と構造の機能 (たとえば、幅シナプス間隙の寸法を決定するためまたはシナプス後密度4、5の直径)。
ワークフローでは、サンプリング (RPS) のソフトウェア (スクリプト ソフトウェアは我々 の顕微鏡に付属を使用して Java スクリプトで書かれた) 超薄片への関心の定義済み領域内のグリッドの位置を自動的に計算するカスタムメイドのランダムな点を使ってください。RPS ソフトウェアは、電子顕微鏡写真は、各ポイントで行うことができますので、電子顕微鏡のステージをこれらのあらかじめ定義されたポイントに移動します。まず、ユーザーは関心薄いセクション内の領域を定義します。次に、RPS のソフトウェアは、この領域内のグリッドの位置を計算します。X/最初の位置の y 座標をランダムに作成され、残りの位置は、最初の位置に点で通常のグリッド間隔で配置されます。関心領域のすべての部分は検査対象の同じチャンスがあるのでこれは最小限のデータ コレクションを実行できます。サンプリングのこのアプローチは組織的均等にランダム サンプリングとも呼ばれます (を参照してください詳細については、6、7を参照)。
構造物の数値の密度を決定するため、離れた既知の距離にあるセクションのペアで取り組んでいます。電子顕微鏡写真を所定の位置の 1 つの最初のセクションから取得後、電子顕微鏡連続切片ソフトウェア (私たちの電子顕微鏡に付属しているソフトウェア パッケージの一部) を移動 2 番目のセクションの対応するポイントに対応する位置の電子顕微鏡写真を取得します。定義済みのグリッド内のあらゆる場所にこれを繰り返します。我々 のアプローチで、disector を使用して、電子顕微鏡写真8,9の各ペアの粒子数をカウントします。Disector は、カウント フレーム各セクション8,9の 1 つのペアで構成されます。オブジェクトの分布密度のみ表示されるオブジェクトをカウントすることによって決定されます最初のセクション (または参照セクション) はなく、2 番目のセクション (または参照セクション)。これにより、高速かつ効率的な方法8,9内のオブジェクトの数値の密度を推定します。さらに 1 つのセクションに二次元の構造的特徴を測定できます。
豊かな環境 (EE) 住宅住宅条件4、5、標準的な環境 (SE) と比較して条件にさらされたマウスの海馬のシナプス数の違いを評価するために正常にこのワークフローに用いています。また野生型 (WT) マウスと神経ペプチド Y(NPY) KO マウスの微細構造の違いを評価する SE と EE5の下で続けた。我々 の目標を見ていた具体的数値のシナプス密度などのニューロンの構造的特徴断面にアクティブなゾーンとシナプス後密度、シナプス間隙とシナプス小胞の数の幅の長さために神経接続と異なる実験条件の間活性化の変化を評価します。さらに、特定の脳領域のストアドの神経ペプチドの量を決定するニューロンの芯小胞 (DCV) の分布密度に関心がありました。
次の手順では、上記で説明した研究の取り組みの成功に基づいて人間の脳のサンプル内の公平な元素分析の領域を選択する私たちのワークフローを適応しています。これは、イメージの鉄は、フェリチン分子神経細胞とグリア細胞の両方に格納されます。このため、我々 は定義された領域内の脳のセクションのランダムなスクリーニング プロセスの操作のほとんどを自動化できるスクリプトをコンパイルしました。
ここに示すワークフローでは、研究者は公平な方法で超微細構造の機能でデータを取得できます。これは連続切片からボリューム調査より大いにより少なく時間のかかるです。複数の異なるアプリケーションは、この目標を達成するために使用されます。最初は、当社のカスタムメイドのRPSのソフトウェア (可用性の詳細については、対応する著者までご連絡ください) が用いられるサンプリング領域の座標を選択するランダム ステージ シフトを導入します。これにより、投資収益率の体系的な均等にランダム サンプリング。次に、特定の構造をカウントするため我々 は以前研究13,14,15従来に比べて斬新な方法で、既知の距離と 2 つの連続したセクションの比較、disector メソッド、適応の体系的な均等にランダム サンプリングのカスタムメイドの RPS ソフトウェア。これは連続切片からボリューム全体を 3 D 再構成と比べて時間を節約できます。カスタムメイドの RPS ソフトウェアはワークフローを再現するための制限要因である顕微鏡の種類用に特に開発します。この特定のソフトウェアからの代替をスクリプトことができます、他の機種と互換性のあるアプリケーションとなります。
我々 は正常に私たちの比較研究4、5のこのアプローチを使用しました。神経組織の超薄切片の関心のある領域を説明した、このエリア内で体系的な均一ランダム サンプリングによる撮影を行った。利子海馬歯状回の多形層の領域が我々 のアプローチに有益なことを調査するためではなく小さな領域をあることに注意する必要があります。ランダムに配置された disector 内 DCV の数を評価し、, アダルト NPY ノックアウト マウスとマウス SE EE と大人 WT 入って成体マウスの DGpl におけるシナプスの微細構造機能がいくつか.我々 のアプローチを使用して、収集したデータは、調査のパラメーターのいくつかの変化を示した。これらの調査結果は、幼若動物2の他の同様の研究からのものを確認しました。
このワークフローの実験的使用法の欠点は、ユーザーが (私たちの場合は、ユーザー インターフェイス、TEM シリアル セクションで異なるユーザー インターフェイスに慣れる必要があると、このマルチ アプリケーション アプローチは利便性の面で理想的なないことかもしれません、RPS のソフトウェア、および SerialEM ソフトウェア)。効率的な方法ですべてのアプリケーションを扱うことを学ぶ時間がかかるは、考慮する必要があります。ただし、このワークフローを使用する方法の学習に時間を投資はまだ明確に有利なシリアル断面 TEM 全体ボリュームを分析に必要な時間をかけて。関心のある分野の体系的な均一ランダム サンプリングによって配置 disector を使用しての方法は、セクション/ボリュームの高い金額を調査することがなく信頼性の高いデータ1を提示すれば十分です。
私たちの研究の結果を最大にするには、だったサンプル準備中に良い世話をする重要な組織と構造の保全は関心のある領域を明確に識別するためにも、構造の機能を評価するために重要ではないです。極めて重要な要因、おそらくこのメソッドの欠点は超薄切片のペアの高品質が必要である: 必要があります穴やしわ、セクションのいずれかでの調査で領域をカバーして切片厚がある必要があります同質を維持しました。研究者は、よく訓練された超でなければなりません。ケアは、イメージング、TEM のセクションのセクションの電子線照射損傷に敏感であるし、容易に引き裂くことができるときに取られるもあります。さらに、投資収益率のサンプリング領域の適切な数を選択することが重要です。実験の目的に応じて電子顕微鏡の倍率は慎重に設定します。実験の具体的には、中枢神経系のシナプスを数える 30.25 μ m2の領域に 1 つのセクションの利子の 20 地域が最適。信頼性の高い結果を得るため (当社の場合シナプス、シナプス機能と DCV) で、問題の機能を認識し、人材育成をお勧めします。シナプスを識別するためにシナプスの小胞を識別する必要があります、これは少なくとも 10 の解像度を必要とする nm。このため、5000 X の倍率は最適なだが、倍率が種類やカメラの位置などハードウェアのパラメーターに依存し、他の顕微鏡やカメラの種類について、適合する必要がありますに注意します。プロトコルが 1 つの TEM に固有のアプリケーションを使用することと、他のモデルとユーザーがセットアップの違いを考慮することを明記しています。
当社のワークフローについて、適合できるだけでなく神経科学、生物科学、また物質科学の幅広い分野で他の多くのアプリケーション (電子顕微鏡の高分解能が必要な) 場合研究の質問は、体系的な制服が要求されたときと考えていますランダム サンプリングと試料の量は、分析の時間の効率的な方法を求めています。たとえば、現在ヒトの脳における鉄店のローカライズに興味を持っております。このため、我々 は最近ランダムに選択されたエリアの超薄切片の元素分析を有効にする、私たちのワークフローを適応しています。ワークフローに必要なアプリケーションの数を最小限にするため事前ランダムに選択することができますポイントを設定する段階を移動するプログラミング可能であるのでだけ、SerialEM ソフトウェアを使用してを適用する目的とします。ワークフローを完全自動化することを目的に、TEM を制御するための独自のスクリプトを作成しました。これは満足のいく結果に至らなかったフィルターの画像モードでオート フォーカスを除いて可能な証明。したがって、焦点を当て、エネルギー フィルター画像を得る DM のソフトウェアを使用しました。
要約すると、公平な方法で電子顕微鏡像を得ることに支援するソフトウェア ソリューションを紹介します。
The authors have nothing to disclose.
FWF、オーストリア科学基金プロジェクト番号 P 29370 B27 によって資金を供給
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |