אנחנו מציגים את הרומן זרימת עבודה מיקרוסקופ אלקטרונים החקירות של רקמת המוח. השיטה מאפשרת למשתמש לבחון תכונות עצביים בצורה לא משוחדת. לצורך ניתוח היסודות, אנו מציגים גם קובץ script automatizes רוב זרימת העבודה עבור דיגום אקראי.
חקירות של התכונות ultrastructural של הנוירונים, הסינפסות שלהם אפשריים רק עם מיקרוסקופ אלקטרונים. במיוחד עבור הפצות של תכונות כגון השוואתית של השינויים בצפיפויות, פרוטוקול דגימה לא משוחד חיוני עבור תוצאות אמינות. כאן, אנו מציגים זרימת עבודה עבור רכישת התמונה דגימות המוח. זרימת העבודה מאפשר דגימה אקראית שיטתית אחיד בתוך אזור המוח מוגדר, התמונות ניתן לנתח באמצעות של disector. טכניקה זו היא הרבה יותר מהר מאשר בדיקה נרחבת של מקטעים טורי אבל עדיין מציג גישה אפשרית כדי להעריך את צפיפויות ואת הפצות של תכונות ultrastructure. לפני הטבעה, סעיפים מוכתמים vibratome שימשו כנקודת התייחסות לזהות את האזור במוח תחת חקירה, אילו עזרתי להאיץ הכנה הכוללת הדגימה את תהליך. גישה זו שימשה השוואתי לחקור את ההשפעה של סביבה מועשרת-דיור על מספר פרמטרים ultrastructural במוח העכבר. בהתבסס על השימוש המוצלח של זרימת העבודה, שינינו אותה למטרת ניתוח היסודות של דגימות המוח. אנחנו אופטימיזציה הפרוטוקול מבחינת הזמן של אינטראקציה של המשתמש. אוטומציה של כל השלבים גוזלת זמן באמצעות קומפילציה קובץ script עבור תוכנת קוד פתוח SerialEM מסייעת למשתמש להתרכז העבודה העיקרית של רכישת המפות היסודות. כמו זרימת העבודה המקורית, שילמנו תשומת לב את הגישה מוטים הדגימה כדי להבטיח תוצאות אמינות.
במיקרוסקופ אלקטרונים, לעתים קרובות מאתגרת לדגימת אזורים נציג בתוך הסעיפים. אנו, כצופה, לעיתים קרובות מוטים להסתכל על אזורים ספציפיים נמשך לידיעתנו על ידי תכונות בולט של המדגם, מניעת מדגם יופץ. ובכן, לא משוחד. דגימה מוטה יכול רק להימנע אם כל חלק של האזור עניין מקבל את ההזדמנות אותו בסוף אלקטרון micrograph1. זה אפשרי למנוע דגימה מוטה ללא פתרון תוכנה, לדוגמה, על-ידי לחיצה על כדור העקיבה של המיקרוסקופ באופן ידני בלי להסתכל התמונה, כדי לבחור אזורי דגימה בכל מקום הבמה עוצר. אבל הצר, זה לא הליך אקראית, כי, במודע או שלא במודע, המשתמש יכול להשפיע על תנועת הבמה, ואת, יתר על כן, זו אינה דרך מתוחכמת של בחירת אזורים הדגימה. דגימה אקראית הופך להיות חשוב במיוחד אם זוגות של מקטעים משמשים כדי להעריך את מספר מבנים אמצעי מסוים, לדוגמה, עבור stereology1, אשר דורשת זוגות של מקטעים, במרחק ידוע מזה. זה גם יהיה אפשר להסתכל רק מקטע יחיד להעריך את מספר מבנים ספציפיים2, אבל עם גישה זו חוקרים נוטים להפריז הצפיפות המספרי של מבנים גדולים יותר, אלא אם המבנים הם קטנים מאוד השוואה עם העובי סעיף. גישות חלופיות הן לשחזר אמצעי אחסון של רקמות ממקטעים טורי, וכך לקבל את הנתונים הרצויים3. אבל זה זמן מאוד לצרוך וגישה לא ריאלי לחקר השוואתי (גדול).
כדי להתגבר על בעיות אלה, פותחו זרימת עבודה המאפשר החוקר לבחור דוגמאות להשגת אלקטרון micrographs-מרווח קבוע בתוך סעיפים דקים. המיקום של micrographs אלקטרון הוא אקראי, ומאפשר דגימה לא משוחדת. הגישה מתאימה הן לקביעת צפיפות המספרי של מבנים (לדוגמה, הסינפסות בתוך מסוימים מורכב נפח4,5), את הממדים של תכונות מבניות (לדוגמה, רוחב החריץ סינפטית, או הקוטר של צפיפות postsynaptic4,5).
זרימת העבודה משתמשת נקודה אקראית מחוייט דגימה תוכנה (RPS) (שנכתב ב Java script באמצעות Scripting התוכנה שסופקה עם מיקרוסקופ שלנו) מחשב באופן אוטומטי עמדות ברשת בתוך אזור מוגדר מראש של עניין מקטע דקים. התוכנה RPS עוברת את השלב של מיקרוסקופ אלקטרונים נקודות מוגדרות מראש אלה, כך micrograph אלקטרון יכול להתבצע בכל נקודה. ראשית, המשתמש מגדיר אזור עניין בתוך המקטע דק. לאחר מכן, התוכנה RPS מחשב עמדות ברשת בתוך אזור זה. ה-x / y הקואורדינטות של העמדה הראשונה נוצרות באופן אקראי, ועל המקומות הנותרים ממוקמים במרווחים רשת רגיל בכל הנוגע העמדה הראשונה. כי כל חלק של האזור של עניין יש אותו סיכוי של נבדק, הדבר מאפשר איסוף נתונים מינימלית. גישה זו של דגימה נקראת גם דגימה אקראית שיטתית אחיד (ראו הפניות6,7 לפרטים נוספים).
לקביעת הצפיפויות המספרי של מבנים, אנו עובדים עם זוגות של מקטעים הנמצאים מרחק ידוע בנפרד. לאחר קבלת micrograph אלקטרון מהסעיף הראשון באחד המיקומים מראש, סעיף טורי TEM תוכנה (החלק של חבילת התוכנה שקיבלת עם מיקרוסקופ אלקטרונים שלנו) עובר עד לנקודה המתאימה במקטע השני, על מנת להשיג micrograph של אלקטרונים של המיקום המתאים. זה חוזר על עצמו עבור כל מיקום ברשת מוגדר מראש. בגישה שלנו, disector משמש כדי לספור את מספר החלקיקים בכל צמד אלקטרון micrographs8,9. Disector כולל זוג ספירת מסגרות, אחד עבור כל סעיף8,9. הצפיפות המספרי של אובייקטים נקבעת על-ידי רק לספור חפצים גלוי במקטע הראשון (או התייחסות בסעיף) אך לא על המקטע השני (או סעיף בדיקת מידע). פעולה זו מאפשרת להעריך את צפיפויות המספרי של אובייקטים דרך מהירה ויעילה8,9. בנוסף על מקטעים בודדים, תכונות מבניות מימדי ניתן למדוד.
אנחנו החלת זרימת עבודה זו בהצלחה כדי להעריך את ההבדלים במספרים סינפסה בהיפוקמפוס של עכברים שנחשפו לסביבת מועשר (EE) לעומת הסביבה סטנדרטי (SE) דיור התנאים4,5, מתנאי הדיור גם להעריך את ההבדלים ultrastructural בין פראי סוג (WT) עכברים neuropeptide Y (NPY) KO עכברים נשמרים תחת SE ו הנדסת חשמל5. היעד שלנו היה להסתכל באופן ספציפי על תכונות מבניות של הנוירונים, כגון דחיסות סינפטית מספריים, המרחק של אזור פעיל בחתכים ושל צפיפות postsynaptic, רוחב החריץ סינפטית, ומספר הסינפטיות, כדי להעריך שינויים בקישוריות העצבית והפעלה בין התנאים ניסיוני שונים. בנוסף, היינו מעוניינים הצפיפות המספרי של ליבה צפופה שלפוחית (DCV) בנוירונים כדי לקבוע את כמות neuropeptides המאוחסן באזור מסוים במוח.
בהתבסס על ההצלחה של הגישה שלנו עבור המחקרים שתוארו לעיל, בשלב הבא שלנו, אנחנו הסתגלו שלנו זרימת העבודה כדי לבחור אזורים לא משוחד מנתח היסודות בתוך דגימות המוח האנושי. זה נעשה כדי התמונה ברזל, אשר מאוחסן בקשירת ברזל המולקולות של נוירונים ותאי גליה. בשביל זה, חיברנו קובץ script אשר אפשרה לנו להפוך לאוטומטי רוב הפעולות עבור תהליך ההקרנה אקראי סעיפים המוח באזור מוגדר.
זרימת העבודה המוצגת כאן מאפשר החוקר לקבל נתונים על תכונות ultrastructural בצורה לא משוחדת. . זה הרבה פחות לארוך זמן רב יותר נפח חקירות ממקטעים טורי. מספר יישומים שונים משמשים להשגת מטרה זו. בהתחלה, התוכנה שלנו- RPS בהזמנה אישית (עבור פרטים על זמינות, אנא צרו קשר עם המחבר המקביל) משמש כדי להציג את הבמה-משמרת אקראי כדי לבחור את הקואורדינטות אזור הדגימה. דבר זה מאפשר דגימה אקראית שיטתית אחיד של רועי. בשלב הבא, עבור ספירה של מבנים ספציפיים, שינינו את שיטת disector, שבו מושווים 2 חתכים רצופים עם מרחק ידוע, בדרך מקורית לעומת מחקרים קודמים13,14,15 כפי שנהגנו שלנו RPS תוכנות עבור דגימה אקראית שיטתית אחיד. פעולה זו חוסכת זמן לעומת 3D-שחזור כל אמצעי אחסון ממקטעים טורי. התוכנה RPS בהזמנה אישית מפותחת במיוחד עבור סוג אחד של מיקרוסקופ הוא גורם מגביל לשחזור זרימת העבודה. חלופה מתוכנה מסוימת זו יהיה יישום זה מאפשר scripting, התואם לדגמים אחרים מיקרוסקופ.
אנחנו משתמשים בהצלחה גישה זו שלנו השוואתי4,5. על חלקים דקים של הרקמה העצבית, תחום העניין היה המתוארים, התמונות צולמו על ידי דגימה אקראית שיטתית אחיד בתוך אזור זה. יש לציין כי האזור של עניין, השכבה פולימורף של הכישור משוננת, הוא אזור קטן למדי לחקור אשר עשוי להיות מועיל עבור הגישה שלנו. תוך disector המונחות, הערכנו את מספר DCV, מספר תכונות ultrastructural של סינפסות DGpl של עכברים בוגרים שוכנו SE, הנדסת חשמל, כמו גם למבוגרים WT עכברים לעומת עכברים knockout NPY למבוגרים. באמצעות הגישה שלנו, הנתונים שנאספו הראו שינויים בחלק מהפרמטרים ובדוקים. ממצאים אלה אישר על אלה מחקרים דומים אחרים חיות לנוער2.
החיסרון של שימוש ניסיוני זרימת עבודה זו ייתכן כי ריבוי-application-גישה זו אינו אידיאלי מבחינת ידידותיות למשתמש, המשתמשים צריכים להרגיש בנוח עם ממשקי משתמש שונה (במקרה שלנו, הממשק למשתמש, סעיף טורי TEM RPS, ותוכנות SerialEM). ללמוד להתמודד עם כל היישומים בדרך יעילה נמצא זמן רב, צריך להילקח בחשבון. משקיע את הזמן בלימוד השימוש זרימת עבודה זו זאת, עדיין בבירור חיובית לאורך זמן אשר יש צורך לנתח כל אמצעי אחסון עם טורי מקטע TEM. השיטה של שימוש disector שבוצעה על-ידי שיטתית דגימה אקראית אחיד באזור עניין מספיקה להציג נתונים אמינים1 ללא צורך לחקור את כמות גבוהה של חלקים/אמצעי האחסון.
על מנת למקסם התוצאה בלימודים, זה היה חיוני לקבל טיפול טוב במהלך הכנת הדוגמא, שימור הרקמה ולמבנים בלבד אינה קריטית להערכת תכונות מבניות, אלא גם לזיהוי האזור עניין חד משמעית. גורם מרכזי, אולי עוד חסרון של שיטה זו, היא כי באיכות גבוהה של זוגות סעיפים דקים נדרש: חייב להיות ללא חורים או קמטים כך שתכסה את האזור תחת חקירה באחד הסעיפים, ועל העובי סעיף להיות לשמור על הומוגניות. החוקר צריך להיות מאומנים היטב ultramicrotomy. טיפול יש גם יש לנקוט כאשר הדימות בסעיפים TEM, כפי הסעיפים רגישים נזק הקורה אלקטרון ולא ניתן להפריד בקלות. יתר על כן, חשוב לבחור את המספר הנכון של אזורים דגימה של רועי. בהתאם המטרה ניסיוני, ההגדלה של micrographs אלקטרון יש להגדיר בקפידה. לניסויים שלנו בפרט, ספירת הסינפסות במערכת העצבים המרכזית, 20 מחוזות ריבית על מקטע אחד עם השטח של מיקרומטר 30.252 הם אופטימליים. מומלץ להכשיר כוח אדם טוב בזיהוי התכונות המדובר (ב שלנו הסינפסות במקרה, תכונות סינפטית ו DCV) כדי לקבל תוצאות אמינות. כדי לזהות הסינפסות, הסינפטיות חייב להיות ניתן לזיהוי ודורש זאת ברזולוציה של פחות 10 ננומטר. בשביל זה, הגדלה של 5000 X היה אופטימלי, אבל זה חייב לציין כי ההגדלה תלויה בחומרה פרמטרים כגון לסוג ולמיקום של המצלמות צריכים להתאים לסוגים אחרים מיקרוסקופ ו/או מצלמה. יש גם לציין כי הפרוטוקול משתמשת יישומים ספציפיים עבור TEM אחד, כי משתמשים עם דגמים אחרים יש לשקול את ההבדלים בכיוונון.
אנו מאמינים שזרימת העבודה שלנו ניתן להתאים ליישומים רבים אחרים לא רק במדעי המוח אלא בשדה רחב של המדע הביולוגי גם חומר מדעי (כאשר הרזולוציה הגבוהה של TEM נדרש) בכל פעם שאלת המחקר דורש מדים שיטתית דגימה אקראית ואת כמות דגימות להיבדק מבקש זמן דרך יעילה של ניתוח. לדוגמה, אנו מעוניינים כיום לוקליזציה מאגרי ברזל במוח האנושי. בשביל זה, אנחנו הסתגלו לאחרונה זרימת העבודה שלנו, כדי לאפשר ניתוח היסודות על סעיפים דקים באזורים שנבחרו באקראי. על מנת לצמצם את מספר היישומים הנדרשים עבור זרימת העבודה, כיוונו ליישם בעזרת התוכנה SerialEM בלבד, כי זה יכול להיות מתוכנת כדי להזיז את הבמה כדי להגדיר מראש את נקודות שניתן לבחור באופן אקראי. יצרנו קבצי script מותאמים אישית כדי לשלוט TEM, במטרה automatizing זרימת העבודה לגמרי. זה הוכיח האפשריים חוץ autofocusing שותק במצב הדמיה מסוננים, אשר לא נכנע מספק תוצאות. ולכן השתמשנו מיט תוכנה למיקוד, להשגת תמונות אנרגיה-מסוננים.
לסיכום, אנו מציגים פתרונות תוכנה לסייע בהשגת אלקטרון micrographs בצורה בלתי לא משוחדת.
The authors have nothing to disclose.
ממומן על ידי קרן המדע האוסטרי, FWF, פרויקט מספר P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |