我们介绍了一种新的脑组织电子显微镜研究工作流程。该方法允许用户以无偏见的方式检查神经元特征。对于元素分析, 我们还提供了一个脚本, 该脚本自动化了随机采样的大部分工作流。
只有用电子显微镜才能研究神经元及其突触的超微结构特征。特别是对于这些特征的密度和分布变化的比较研究, 无偏采样协议对于可靠的结果至关重要。在这里, 我们提出了一个工作流程的图像采集的大脑样本。工作流允许在定义的大脑区域内进行系统统一的随机抽样, 并且可以使用检测器对图像进行分析。该技术比串行截面的广泛检测要快得多, 但仍为估计超微结构特征的密度和分布提供了一种可行的方法。在嵌入之前, 用染色振动段作为识别正在调查的大脑区域的参考, 这有助于加快整个标本的制备过程。该方法用于比较研究, 研究环境对小鼠大脑中几种超微结构参数的影响。在成功使用工作流的基础上, 我们对其进行了调整, 以便对大脑样本进行元素分析。我们根据用户交互的时间对协议进行了优化。通过为开源软件 SerialEM 编译脚本来自动化所有耗时的步骤, 可帮助用户专注于获取元素映射的主要工作。与原始工作流程一样, 我们注重无偏采样方法, 以保证可靠的结果。
在电子显微镜中, 在各部分中对有代表性的区域进行采样通常是很有挑战性的。作为观察员, 我们经常偏向于通过样本的显著特征来看待提请我们注意的特定区域, 从而防止了一个分布良好、无偏见的抽样。只有当感兴趣区域的每个部分都有相同的机会最终进入电子显微镜1时, 才能避免采样偏差。在没有软件解决方案的情况下, 可以避免采样偏差, 例如, 在不查看图像的情况下手动推下显微镜的轨迹球, 以便在舞台停止的任何位置选择采样区域。但严格地说, 这不是一个随机的过程, 因为, 有意识或潜意识, 用户可以对舞台的运动有影响, 而且, 这不是一个复杂的方式来选择采样区域。如果使用对截面来评估某个体积中的结构数量, 随机采样就变得特别重要, 例如, 对于立体学1, 它需要对截面, 即已知的距离。也可以只看一个部分, 估计具体结构的数量 2, 但有了这种方法, 调查人员往往高估了较大结构的数值密度, 除非这些结构在与截面厚度的比较。另一种方法是从连续截面重建组织体积, 从而获得所需的数据3。但这是非常耗时的, 不是一个可行的方法 (较大) 的比较研究。
为了克服这些问题, 我们开发了一个工作流程, 允许研究人员自动选择样本, 以便在超薄截面内以固定的间距获得电子显微镜。电子显微镜的位置是随机的, 允许无偏采样。该方法既适用于确定结构的数值密度 (例如, 特定神经 pil 卷 4,5内的突触), 也适用于结构特征的尺寸 (例如, 突触裂隙的宽度,或突触后密度的直径4,5)。
工作流使用定制的随机点采样 (RPS) 软件 (使用我们显微镜提供的脚本软件用 Java 脚本编写), 该软件在超薄截面上自动计算预定义区域内的网格位置。RPS 软件将电子显微镜的各个阶段移动到这些预定义的点, 以便在每个点上都能制作出电子显微镜。首先, 用户在薄截面中定义感兴趣的区域。接下来, RPS 软件计算此区域内的网格位置。第一个位置的 xy 坐标是随机创建的, 其余位置相对于第一个位置按固定的网格间隔放置。由于感兴趣区域的每个部分都有相同的机会被检查, 这允许最小的数据收集。这种抽样方法也称为系统统一随机抽样 (更多细节见参考 6,7 )。
为了确定结构的数值密度, 我们使用的是已知距离的截面对。在从预定位置的第一部分获得电子显微镜后, TEM 串行部分软件 (由我们的电子显微镜提供的软件包的一部分) 移动到第二部分的对应点, 以便得到相应位置的电子显微镜。这对于预定网格中的每个位置重复。在我们的方法中, 一个检测器用于计算每一对电子显微镜8,9中的粒子数量。一个分解器由一对计数帧组成, 每个部分8,9一个。对象的数值密度仅由在第一节 (或参考部分) 上可见的计数对象确定, 而不是由第二节 (或查找部分) 上可见的计数对象确定。这样就可以快速有效地估计物体的数值密度8,9。此外, 在单截面上, 还可以测量二维结构特征。
我们成功地应用了这一工作流程来评估暴露在丰富环境 (ee) 住房条件下的小鼠海马突触数与标准环境 (se) 住房条件的差异 4,5,并评价在 SE 和 EE5下的野生 (wt) 小鼠与神经肽 y (npy) ko 小鼠的超微结构差异。我们的目标是特别研究神经元的结构特征, 如数字突触密度、横截面活动区的长度和突触后密度、突触裂隙的宽度以及突触囊泡的数量,以评估不同实验条件之间神经元连接和激活的变化。此外, 我们感兴趣的数字密度密度的致密核囊泡 (DCV) 在神经元, 以确定在一定的大脑区域储存的神经肽的数量。
基于我们在上述研究中的成功之处, 在下一步, 我们调整了工作流程, 以选择在人脑样本中进行无偏元素分析的区域。这是为了成像铁, 它储存在铁蛋白分子中的神经元和胶质细胞。为此, 我们编译了一个脚本, 使我们能够自动执行大多数操作, 对定义区域中的大脑部分进行随机筛选。
这里介绍的工作流程允许研究人员以公正的方式获取有关超微结构特征的数据。与串行部分的批量调查相比, 这耗费的时间要短得多。为实现这一目标, 使用了几种不同的应用程序。首先, 我们定制的Rps软件 (有关可用性的详细信息, 请联系相应的作者) 用于引入随机阶段转换来选择采样区域坐标。这样就可以对 ROI 进行系统统一的随机抽样。接下来, 对于特定结构的计数, 我们采用了分解方法, 以一种新的方式比较了两个已知距离的连续部分, 与以前的研究13,14, 15 相比,我们使用我们的定制的 RPS 软件, 用于系统均匀的随机抽样。与从串行截面进行三维重构整个卷相比, 这节省了时间。定制的 RPS 软件是专门为一种类型的显微镜开发的, 它是复制工作流的限制因素。此特定软件的另一种方法是允许编写脚本并与其他显微镜模型兼容的应用程序。
我们成功地将这种方法用于比较研究4,5。在神经元组织的超薄部分上, 概述了感兴趣的区域, 并在该区域内进行了系统均匀的随机抽样, 拍摄了图像。必须指出的是, 感兴趣的区域, 齿状回的多形性层, 是一个相当小的研究区域, 这可能有利于我们的方法。在随机放置的检测器中, 我们评估了位于 SE 和 EE 中的成年小鼠 DGpl 中 dgpl 中 dgpl 中 DGCV 的数量和突触的几种超微结构特征, 以及成年 WT 小鼠与成年 NPY 敲除小鼠的数量。使用我们的方法, 收集到的数据显示了一些被调查参数的变化。这些发现证实了其他类似研究的少年动物2。
此工作流的实验用法的一个缺点可能是, 这种多应用程序方法在用户友好性方面并不理想, 因为用户需要适应不同的用户界面 (在我们的情况下, 用户界面, TEM 串行节), RPS 软件和序列化程序软件)。学会以高效的方式处理所有应用程序是耗时的, 应该加以考虑。然而, 投入时间学习使用此工作流仍然是有利的时间, 这是需要分析整个卷与串行部分 TEM。在感兴趣的区域内使用系统均匀随机抽样放置的检测器的方法足以提供可靠的数据1 , 而无需研究大量的分段体积。
为了在我们的研究中最大限度地发挥结果, 在样品制备过程中必须小心, 因为组织和结构的保存不仅对评估结构特征至关重要, 而且对明确确定感兴趣的领域也至关重要。这种方法的一个关键因素, 也许也是另一个缺点, 就是需要高质量的超薄截面对: 在任何一个截面上, 都必须没有覆盖被调查区域的洞或皱纹, 并且截面厚度必须是保持均匀。研究人员必须在超微切除术方面有良好的培训。在对 TEM 中的截面进行成像时, 也必须小心, 因为这些截面对电子束损伤很敏感, 很容易撕裂。此外, 在 ROI 中选择合适的采样区域数量也很重要。根据实验目的, 电子显微镜的放大倍率必须仔细设置。具体对于我们的实验, 计算中枢神经系统中的突触, 面积为 30.25μm2的一个部分上的20个感兴趣的区域是最佳的。建议对人员进行良好的培训, 以识别相关特征 (在我们的情况下, 突触, 突触特征和 DCV), 以获得可靠的结果。为了识别突触, 突触囊泡必须是可识别的, 这需要至少10纳米的分辨率。为此, 5000X 的放大倍率是最佳的, 但必须注意的是, 放大倍率取决于硬件参数, 如相机的类型和位置, 需要适应其他显微镜和/或相机类型。还必须注意的是, 协议使用的应用程序特定于一个 TEM, 具有其他模型的用户必须考虑设置中的差异。
我们相信, 只要研究问题需要系统的统一, 我们的工作流程不仅可以适应神经科学的许多其他应用, 还可以适应生物科学和材料科学的广泛领域 (当需要 TEM 的高分辨率时)随机抽样和要检查的样本量要求有一个时间效率的分析方法。例如, 我们目前对在人脑中本地化铁储存感兴趣。为此, 我们最近调整了我们的工作流程, 以便能够对随机选择的区域中的超薄截面进行元素分析。为了最大限度地减少工作流所需的应用程序数量, 我们的目标是仅使用 SerialEM 软件, 因为可以对其进行编程, 以便将舞台移动到可随机选择的预设点。我们创建了自定义脚本来控制 TEM, 目的是使工作流完全自动化。这证明是可行的, 但在滤波成像模式下自动对焦, 没有得到满意的结果。因此, 我们使用 DM 软件进行聚焦和获取能量过滤图像。
总之, 我们提出的软件解决方案, 以帮助获得电子显微镜在一个公正的方式。
The authors have nothing to disclose.
由奥地利科学基金资助, FWF, 项目编号 P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |