בידוד, Decellularization פוג'אלאדוצ'נוי זהאלאזי כל חזירי

ניתוח לבלב חזירי וההליך decellularization המובאת כאן את ההנחיות האתית של אוניברסיטת גטבורג. 1. הכנת קביעת Decellularization באמצעות צינורות סיליקון 3 x 5 מ מ, התחברות בסדרת המכולה כניסת דטרגנט המשאבה peristalic ועל ואז על הלבלב באיבר קאמרית ויה degasser (ראה איור 1). להתחבר עם סכינים סטריליים זכר לסוף צינור בחדר איברים ללא תשלום. באמצעות צינור סיליקון אחר של 3 x 5 מ מ, להתחבר לחדר עוגב אאוטלט דטרגנט מיכל דרך משאבת סחרור לאיסוף הנוזל perfused. להתחבר פיפטה ללא תווית של 2 ml הפנויות של צינורות כניסת דטרגנט המכיל ולא דטרגנט שקע cointainer. לשמור את כל התרמית ב 4 º C. איור 1: הכנת הסידור זלוף. באמצעות צינור סיליקון 3 x 5 מ מ, כפי שמוצג בקביעת, להתחבר בסדרת המכולה כניסת דטרגנט את משאבת סחרור, את degasser ואת תא איברים. החצים השחורים מראה לכם את הכיוון זרימה של כניסת דטרגנט מכיל לתא איברים עבור השקע דטרגנט, להשתמש עוד 3 x 5 מ מ סיליקון שפופרת וחבר את איבר קאמרית באמצעות משאבת סחרור המכולה עודפים דטרגנט. החיצים האדומים מראה לכם את הכיוון זרימה של איברים קאמרית לגורם עודפים דטרגנט אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 2. הכנת Decellularization פתרונות פתרון 1 (באגירה פוספט תמיסת מלח [PBS]): להוסיף 8 גרם של נתרן כלורי (137 מ מ), g 0.2 (2.7 מ”מ) אשלגן כלורי, 1.44 גר’ (10 מ מ) סודיום פוספט ו- 0.24 גר’ (1.8 מ”מ) אשלגן פוספט 1 ליטר של מים הנדסה גנטית ומערבבים עד התפרקה. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם חומצת מלח (HCl). בסך הכל, 3.2 L של פתרון זה נדרש. פתרון 2 (PBS + הפארין): עד 1 L של פתרון 1, להוסיף 3.4 מיליליטר הפרין (17 יחידות הבינלאומי [IU] /mL). להכין טרי הפתרון הזה ולשמור אותו בקרח עד שיהפוך קר. בסך הכל, 1.2 L של פתרון זה נדרש. פתרון 3 (הנדסה גנטית מים + אזיד הנתרן + ניתרן ethylenediaminetetraacetic חומצה [EDTA]): עד 1 L של הנדסה גנטית מים, להוסיף 1.86 g של EDTA (5 מ מ), 200 מ ג של אזיד הנתרן (0.02%). מערבבים עד המלחים הם התפרקה. מגניב הפתרון עד 4 ° C לפני השימוש. בסך הכל, L 22 של פתרון זה נדרש. פתרון 4 (PBS + אזיד הנתרן + EDTA): עד 1 L של פתרון 1, להוסיף 200 מ ג של אזיד הנתרן (0.02%) ו- g 1.86 של (5 מ”מ) EDTA. מערבבים עד המלחים הם התפרקה. מגניב הפתרון עד 4 ° C לפני השימוש. בסך הכל, 1 ליטר של פתרון זה נדרש. פתרון 5 (הנדסה גנטית מים + אזיד הנתרן): עד 1 L של הנדסה גנטית מים, להוסיף 200 מ ג של אזיד הנתרן (0.02%). מערבבים עד המלחים הם התפרקה. מגניב הפתרון עד 4 ° C לפני השימוש. בסך הכל, 260 L של פתרון זה נדרש.הערה: EDTA טפסים של התמיסה עם SDC, נכללו 5 פתרון מאז זה ישמש לרחצה מיידית לפני ואחרי הטיפול SDC. פתרון 6 (SDC + טריטון X-100): 940 מ של מים הנדסה גנטית, להוסיף 40 גרם (4%) SDC, 60 מ ל (6%) טריטון X-100 200 מ ג של אזיד הנתרן (0.02%), 69.6 מ”ג של פלואוריד (0.4 מ מ) phenylmethylsulfonyl (PMSF). מערבבים עד התפרקה. מגניב הפתרון עד 4 ° C לפני השימוש. הוסף PMSF לפני השימוש. בסך הכל, 9.6 L של פתרון זה נדרש. פתרון 7 (DNase): להוסיף קוניץ 10,000 יחידות DNase-אני ב- 250 מ של PBS של Dulbecco (40 קוניץ יחידות/mL) המכיל CaCl2 ו- MgCl2. להכין טרי ולהשתמש מיד. חממו את הפתרון 37 ° C לפני השימוש. פתרון 8 (PBS + נתרן אזיד): עד 1 L של פתרון 1, להוסיף 200 מ ג של אזיד הנתרן (0.02%). מערבבים עד המלחים הם התפרקה. מגניב הפתרון עד 4 ° C לפני השימוש. בסך הכל, 1 ליטר של פתרון זה נדרש. 3. ניתוח של הלבלב חזירי הערה: במחקר זה, הלבלב חזירי היו גזור מן מורדמים, heparinized (400 IU/kg) חזירות במשקל של 45 ק ג של חווה. מקם את החזיר על השולחן לנתיחה במצב פרקדן. עושים קו האמצע חתך מתהליך xiphoidal לעצם החיק (כ 40 ס מ) בעזרת אזמל, חשיפת כל אברי הבטן. לאתר את הטחול, תריסריון, ואת החיבור אונות. אתר רמת papilla תריסריון העיקריים ולחץ מאתרים ומפסיקים התריסריון אורלית מאתר זה בעזרת שני תפרים נפרדים. מאתרים ומפסיקים את הוושט נחות עם שני תפרים נפרד וחותכים בין ליגטורות עם מספריים כדי להוציא את הבטן. להפריד את רקמת המעי הגס כדי להגיע אל המעי הדק. להפריד את רקמת החיבור של המעי הגס שמתחבר האונה הטחול של הלבלב. הסר את המעי הגס המעי הדק לאחר נבדק העורקים. למצוא את וריד מצע המעי העליון נחות והעץ עורק מצע המעי העליון נחות, מאתרים ומפסיקים בתפר אחד שבו יופיעו הקליפה של הלבלב. מאתרים ומפסיקים את עורק הטחול ואת הווריד יחד עם תפר אחד, קרוב הטחול, ב hilum, וחותכים רחוק עם מספריים כדי להסיר את הטחול. בצע את התריסריון עד האונות תריסריון וחיבור נמחקים, מאתרים ומפסיקים התריסריון בסוף עם שני תפרים נפרדים. לנתח את וריד שער הכבד, מאתרים ומפסיקים אותו בתפר אחד כדי למנוע דליפה כלשהי הדם מן הכבד, לחתוך הציר הקרוב קשירה. וריד שער הכבד משמש לפורקן במהלך decellularization. לנתח, מאתרים ומפסיקים את צינור המרה ואת עורק הכבד עם שני תפרים. לחתוך יש תפרים. למצוא העורקים תחת וריד הכליה, לנתח את זה לכיוון הגולגולת של שרירים ורקמות. עד שהוא מגיע לאזור הלבלב. להתהפך הלבלב בעדינות, לנתח את העורקים, שמירה SMA ו- CT תקין, וחותכים העורקים ל CT לכוחו של SMA עם מספריים. לחתוך את הנותרים הרקמות הסובבות עם מספריים, להוציא את הלבלב. באמצעות מזרק 50-mL מחובר arteriotomy 4-מ מ בצינורית, לרוקן את האיבר דרך העורקים עם פתרון 2 עד זה perfuses את כל האיבר או עד האיבר כולו הופך קר. 4. הכנה של הלבלב חזירי Decellularization לשמור על הלבלב ב 4 ° C או על קרח לאורך כל התהליך. לחתוך את התפרים של התריסריון באמצעות מספריים, לנקות את זה של מזון על ידי שטיפה 50-150 מ ל מים הנדסה גנטית בעזרת פיפטה 25-mL ו מאתרים ומפסיקים אותו שוב עם תפרים. מאתרים ומפסיקים את קצה אחד של אבי העורקים ואת כל ענפי חוץ SMA ו- CT עם תפרים למניעת דליפה. הוספת מהקצה השני של אבי העורקים בצינורית 4-מ מ arteriotomy, מאתרים ומפסיקים את זה עם תפרים. Perfuse הלבלב עם פתרון 3 בשביל 1 h ב- 20 מ ל/דקה באמצעות את קביעת decellularization.הערה: Prefill הצינורות של משאבת עם פתרון 3 כזה כי אין בועות הזן הלבלב. לחפש כל leakages מכל הכיוונים של האיבר, מאתרים ומפסיקים סניפים כלי הדם הכל פתוח עם התפרים, למעט וריד שער הכבד. להקפיא הלבלב ב-20 ° C ב- 4 פתרון עד תחילת decellularization. 5. decellularization של הלבלב חזירי הפשרת הלבלב ב 4 º C. הפעל את משאבת סחרור בקביעת decellularization עם פתרון 3 ב- 20 מ ל/דקה עד אין בועות אוויר נראים בצינור כניסת דטרגנט. למקם את הלבלב המכולה decellularization וחבר את צינור כניסת דטרגנט העורקים של הלבלב. לשטוף את איבר המין על ידי זלוף עם פתרון 3 בן לילה-20 mL/min ב 4 º C. יוצקים את הפתרון השאיר בבית הבליעה איברים. להחליף 3 פתרון פתרון 5 ו perfuse הלבלב למשך 30 דקות ב- 20 mL/min ב 4 º C. יוצקים את הפתרון בבית הבליעה איברים. להוסיף פתרון 6, perfuse הלבלב עבור 8 שעות-20 mL/min ב 4 º C. יוצקים את הפתרון בבית הבליעה איברים. לשטוף את איבר המין על ידי זלוף עם 5 פתרון עבור 96 h ב- 20 mL/min ב 4 º C. יוצקים את הפתרון בבית הבליעה איברים. הכן הלבלב לטיפול DNase באמצעות צואה 500 מ ל- PBS של Dulbecco המכילה CaCl2 ו- MgCl2 למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. יוצקים את הפתרון בבית הבליעה איברים. להוסיף 250 מ של פתרון 7, perfuse הלבלב במשך 4 שעות ב- 20 mL/min ב- 37 מעלות צלזיוס. יוצקים את הפתרון בבית הבליעה איברים. לשטוף את איבר המין על ידי זלוף עם 5 פתרון עבור h 120 20 mL/min ב 4 º C. אחסן את האיבר פתרון 8 ב 4 ° C לפרקי זמן קצרים או ב-20 ° C לתקופות ארוכות. 6. אימות של Decellularization בעזרת מספריים, לחתוך ביופסיות 3 עד 10-מ מ מ כל האונות של הלבלב ותקן אותן בפורמלין במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף את החלקים במים הנדסה גנטית למשך 15 דקות, לעבד אותם במעבד רקמות בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים, להטביע אותם בפרפין. סעיפים 5-מיקרומטר באמצעות מיקרוטום גזורה תכתים אותם על ידי hematoxylin ו- 0.2% אלכוהוליים אאוזין של מאייר (הוא) בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים. הצגת השקופיות תחת מיקרוסקופ אור כדי לבדוק על האובדן של גרעין האטום.הערה: קטע רקמה טריים מעובדים באופן זהה יכול לשמש פקד כדי לבדוק נוכחות של גרעין האטום.