光动力疗法 (PDT) 是一个医疗程序, 涉及孵化外部应用光敏剂 (PS) 后, 可见光 photoactivation 诱导细胞凋亡。我们提出了一种体外pdt 协议, 旨在模拟 PDT, 可用于研究不同的 PS 孵化和光处理参数。
光动力疗法 (PDT) 是一个医疗程序, 涉及孵化外部应用光敏剂 (PS) 后, 可见光 photoactivation 诱导细胞凋亡。联邦药物管理局已批准 pdt 治疗日光脂溢性, 临床指南建议 pdt 作为治疗某些非黑色素瘤皮肤癌和寻常痤疮。PDT 是一种有利的治疗方式, 因为它是低成本, 无侵入性, 并与最小的不良事件和惊吓有关。在 PDT 的第一步, 应用 PS, 并允许积累 intracellularly。随后的光照射诱导活性氧的形成, 这可能最终导致细胞凋亡, 膜的破坏, 线粒体损伤, 免疫调节, 角质细胞增殖, 胶原蛋白的更替。在此, 我们提出了一种体外方法来研究 PDT 在黏附细胞系。该治疗协议旨在模拟 pdt, 并可调整以研究使用的 pdt 与各种细胞系, 光敏, 孵化温度, 或 photoactivation 波长。鳞状细胞癌细胞以0、0.5、1.0 和2毫米 5-氨基乙酰丙酸 (5-亚拉巴马州) 孵化, 30 分钟和光活化作用417纳米蓝光。以蛋白和 7-aminoactinomycin D 流式细胞术检测为主要结局指标为凋亡和坏死。在 5-阿拉三十分钟的孵化后, 细胞凋亡的剂量依赖性增加。在体外光动力实验中, 保持一致的孵化和光照参数, 对于提高检测的有效性具有重要意义。pdt 是一个有用的临床程序, 并在体外研究可以为新的 PSs 的发展, 协议的优化, 和新的迹象, pdt。
光动力疗法 (PDT) 是一个医疗程序, 涉及孵化外部应用光敏剂 (PS) 后, 可见光 photoactivation 诱导细胞凋亡。联邦药物管理局 (FDA) 批准了 pdt 治疗日光脂溢性 (AK), 临床指南建议 pdt 作为治疗某些非黑色素瘤皮肤癌和寻常痤疮1,2。新出现的非皮肤病疗法包括胃肠道、前列腺癌和妇科癌症的治疗3。PDT 是一种有利的治疗方式, 因为它是低成本, 无创, 并与最小的不良事件和疤痕2。
在 PDT 的第一步, 应用 PS, 并允许积累 intracellularly2。在美国, 局部 5-氨基乙酰丙酸 (5-阿拉) 通常用于治疗 AKs。在孵化阶段, 5-亚拉巴马州通过在合并细胞中的血红素生物合成途径转化为原卟啉 ix (PP ix)3。癌症和癌前细胞减少了 ferrochelatase 活性, 这将原卟啉 ix (PP ix) 转化为最终产物, 血红素。结果, 与正常细胞4,5相比, 癌细胞积累了 PP IX。这种积累的 PP IX 在癌症和前癌细胞相对于周围组织允许 PDT 是一个有针对性的方法, 最小的不良事件。当氧接受来自 PP ix 的激发电子时, 光辐照会导致活性氧 (ROS) 的产生。PP-IX 在紫外光谱中具有峰值吸收, 在可见光谱中有较小的峰值, 包括蓝色和红光2。ROS 的形成可能最终导致细胞凋亡, 膜破坏, 线粒体损伤, 免疫调节, 角质细胞增殖, 胶原蛋白周转6,7,8,9,10。
PDT 是在二十世纪七十年代发展起来的, 是一种进化的治疗方式3。FDA 批准的治疗 AKs 建议 5-14–18 h 的皮肤孵化, 但1至 2 h 孵化通常用于临床实践2。在体外, 我们已经表明, 较短的15分钟 5-阿拉孵化可能会增加成纤维细胞凋亡相比, 未经处理的成纤维细胞11,12。此外, 研究了新的氯、酞菁和纳米粒子的 PSs, 以提高 PDT 功效3。在此, 我们提出了一种体外方法来研究 PDT 在黏附鳞状细胞癌细胞。在本协议中, SCC-13 细胞以0、0.5、1.0 和2毫米 5-阿拉的孵化为30分钟和光活化作用, 417 nm 蓝色光为 s。主要结果是凋亡和坏死, 蛋白和 7-aminoactinomycin D (7) 流式细胞术测量。该治疗协议旨在模拟 pdt, 并可调整以研究使用 pdt 与其他细胞系, 光敏, 孵化温度, 或 photoactivation 波长。可能需要准备额外的控制组, 包括无瑕, 单荧光染色, 阴性, 和积极的控制流式细胞术。对凋亡/坏死流式细胞术的理论、规程、实验设计和门控进行了全面的回顾, 可在别处找到13。
30分钟孵化、1、2毫米 5-SCC-13 细胞凋亡显著增加, 其次为1000秒蓝光。这些结果与我们以前发表的研究相一致, 证明 5-孵化30分钟后蓝色光激活导致成纤维细胞在细胞凋亡12的百分比增加, 14。
该实验方法对 PDT 的研究具有优势和局限性。所描述的方法符合临床实践作为一个商业上可用的 PS 和光源使用。研究人员可以自定义不同细胞类型、PSs、光源和辐照参数的方法。然而, 这种方法有局限性, 因为这个协议是为在单层培养的黏附细胞设计的。在临床实践中, 组织结构或疾病病理学 (即底角化过度或纤维化) 的差异可能会降低 PS 吸收或光穿透15。因此, 治疗剂量和实验结果可能与临床实践没有直接的对应。以球形肿瘤模型和微流控芯片为方法, 对肿瘤微环境16、17、18进行了较严密的复制。球体有内部和外部细胞的利基, 可能差异纳入光敏和代表异构的肿瘤结构。其他研究人员使用微流控芯片筛选治疗条件和光敏的血管输送。然而, 对于不熟悉该技术的研究人员来说, 微流控芯片的开发或难于实现的成本可能很高。此外, 球体和微流控芯片可能无法反映光敏直接应用于肿瘤表面而无血管传播的皮肤癌的临床治疗。研究人员可能需要评估单层培养、球形肿瘤模型和微流控芯片在不同疾病系统中研究 PDT 的利弊。由于没有免疫细胞或细胞外基质, 因此不可能确定 PDT 如何影响复杂的细胞间相互作用。研究人员可能需要用动物模型和临床试验证实体外实验结果。在体外光动力实验中, 保持一致的孵化和光照参数, 对于提高检测的有效性具有重要意义。
已知温度改变了 PDT19的功效。一项研究表明, 细胞死亡, 5 的摄取, PP IX 的形成, 和细胞因子释放可能会加强孵化细胞与 5-阿拉在温度高达44摄氏度19。44摄氏度以上的潜伏期可能导致热诱导细胞死亡, 孵化温度低于20摄氏度可能不会导致显著的 5-阿拉的摄取和积累19。我们建议研究人员在恒温温度可调的加热块上执行 PS 孵化, 以控制潜在的混杂热效应。此外, 重要的是要孵化的光敏剂足够的时间, 以允许转化为 5-阿拉的 PP ix。在该协议中, SCC-13 细胞以 5-亚拉巴马州为30分钟的孵化, 成功诱导细胞凋亡。我们以前已经证明, 5-阿拉的10分钟孵化并没有显著增加成纤维细胞凋亡与未经处理的控制成纤维细胞11,14。PP-IX 开始积累在小鼠皮肤 5-阿拉孵化六分钟37摄氏度。因此, 经过十分钟的5的孵化, 可能没有足够的积累, PP IX 诱导细胞凋亡20。我们建议的最低潜伏期20至30分钟的 5-阿拉的基础上, 我们以前的研究11,14。研究人员可能需要根据实验室设置、感兴趣的光敏剂、细胞类型和临床指示来优化潜伏期。抗体滴定和优化实验可以执行的最佳结果使用制造商的指导方针。其他的兴趣分析可以执行后, 蓝色光 photoactivation 包括 dihydroethidium 流细胞定量的 ROS。14
在 photoactivation 阶段, 每单位表面积 (即辐照度) 和总辐照剂量 (即通量) 的光含量变化可能会影响 ROS 的形成和细胞凋亡21。通量、辐照度和时间的关系可以用以下等式描述:
剂量 (J/厘米2) = 辐照度 (W/厘米2) x 时间 (s)
由于剂量依赖于时间, 延长或缩短 photoactivation 阶段可能改变治疗效果。辐照度与光源和靶组织的距离平方成正比。因此, 如果光线太远, 可能没有足够的光能传递给目标组织来激发 PS. 或者, 辐照度可以通过反射周围表面的光线来增加。因此, 我们建议执行光辐照与放置在黑色表面的细胞培养板, 以防止光反射。研究人员可能获得商用或 FDA 批准的蓝光发光二极管和荧光器件用于 PDT 实验, 但这些器件可能有不同的功率输出和光场均匀性。每个实验前, 应使用波长特定的光度计测量光场在细胞表面的辐照度和均匀度, 以求得一致的结果。如果有必要, 可使用商用扩散器来提高场的均匀性。
总之, 我们描述了一种体外方法, 通过详述理论、实验方法、局限性、潜在缺陷和优化建议来调查 PDT。pdt 是一个有用的临床程序, 并在体外研究可以为新的 PSs 的发展, 协议的优化, 和新的迹象, pdt。
The authors have nothing to disclose.
作者没有确认。
Keratinocyte serum free medium | Thermofisher | 17005042 | Culture medium for SSC-13 cells |
DMEM low glucose glutamax | Thermofisher | 10567022 | Possible culture medium for other cell types |
6-well culture plates | Thermofisher | 720083 | |
PBS | Thermofisher | 14190250 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25200056 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | For cell counting and plating |
BLU-U light | DUSA | Request from manufacturer | Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used |
5-ALA | DUSA | Request from manufacturer | |
FBS | Atlanta Biologicals | C17032 | |
FlowCellect Annexin Red Kit | Millipore Sigma | FCCH100108 | Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer |
FACSCanto II | BD | Request from manufacturer | Any flow cytometer may be used |
Counting Chamber | Hausser | 3120 | For cell counting and plating |
FlowJo | FlowJo | Request from manufacturer | Flow cytometry analysis software |