Summary

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

Published: July 30, 2018
doi:

Summary

הפרוטוקול מתאר טכניקה ללמוד את היכולת של ראשי תאי T polyclonal האנושי כדי ליצור ממשקים סינפטית באמצעות השומנים מישורי bilayers. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להראות את היכולת היווצרות סינפסה דיפרנציאלית של האדם בתאי T העיקרי נגזר לימפה ודם היקפי.

Abstract

להבנת הדינמיקה הנוכחי ותכונות מבנית של T-cell ממשקי סינפטית כבר נקבע במידה רבה באמצעות הנתמכות על-ידי זכוכית bilayers מישורי, במבחנה-תא T נגזר שיבוטים או קווים1,2 3, ,4. כמה ממצאים אלה חלות ראשי T תאים אנושיים מבודד מן הדם או הלימפה ברקמות אינו ידוע, בין השאר בשל קשיים משמעותיים בהשגת מספר מספיק של תאים עבור ניתוח5. כאן נוכל לטפל בבעיה זו דרך פיתוח טכניקה ניצול הזרימה רב-ערוצי שקופיות כדי לבנות השומנים מישורי bilayers המכילה מולקולות הפעלת והצמדות. הגובה הנמוך של השקופיות זרימה מקדם שקיעת תאים מהירה כדי לסנכרן מצורף תא: bilayer, ובכך לאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של היווצרות ממשק סינפטית וקינטיקה של המהדורה גרגירים. אנו מיישמים גישה זו כדי לנתח את ממשק סינפטית של מעטים כמו 104 עד 105 ראשי cryopreserved תאי T מבודד מן בלוטות הלימפה (LN) ודם היקפי (PB). התוצאות חושפים כי הטכניקה bilayer השומנים מישורי הרומן מאפשר חקר המאפיינים ביופיזיקלי של ראשי האנושי T תאים שמקורם דם ורקמות בהקשר של מחלה ובריאות.

Introduction

הידע המדעי של התכונות מבנית של תא T החיסון הסינפסות ולקשר שלהם לפעילות פונקציונלי של תאי T נוצרה בעיקר מן המחקר של שורות תאים, שיבוטים נגזרת PB. כדי באיזו מידה ממצאים אלה מתייחסות העיקרי בתאי T שהתקבל מן הדם או הלימפה ברקמות אנושיות עדיין לא ברור, כפי שיש הממשקים סינפטית של תאי T המתגוררים רקמות הלימפה ואחרים לא נותחו עד כה. חשוב, המתעוררים הנתונים מראים כי תאי T רקמות תושב ו הלימפה איברים-נגזר יכול להיות הבדלים משמעותיים שלהם פנוטיפ ופעילות תפקודית בהשוואה לאלו ב PB6,7. זה התחזק עוד יותר את הצורך להבין טוב יותר את התכונות של הממשק סינפטית T-cell בתאי T אדם ראשי

לשם כך, פיתחנו בגישה מידה מיני הרומן ניצול שומנים בדם bilayers בנוי לתוך שקופיות רב-ערוצי זרימה המאפשרת לנו לבצע ההדמיה של T-תא/bilayer ממשקים עם פחות מ- 105 ראשי תאי T מבודד PB אנושי, LN. טכניקה חדשנית זו מאפשרת חקר המאפיינים ביופיזיקלי של ראשי אדם T-cell סינפטית ממשקים כדי מודל טוב יותר ולהבין ויוו תא-תא אינטראקציות.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם הצהרת הלסינקי. ממנו כל המשתתפים הושג בכתב הסכמה מדעת, דגימות דם, לימפה נרכשו עם האישור של ועדת הבדיקה מוסדיים ב אוניברסיטת פנסילבניה (IRB #809316, IRB # 815056). כל הנבדקים האדם היו מבוגרים. דגימות דם טבורי נמסרו באדיבות על ידי העבודה ואספקה במחלקת יולדות & גינקולוגיה באוניברסיטת תו?…

Representative Results

ראשית, השווינו את המבנה של הממשק סינפטית הנוצרת על-ידי הופעל CD8 כבל דם-נגזר+ T תאים נחשפים השומנים bilayers נבנה גם זרימה בקנה מידה גדול מסורתיים בתוך מערכות התא (ראה את הטבלה של חומרים לפרטים)1 ,2,3,<sup class="xre…

Discussion

הטכניקה הרומן שמתואר כאן מנצל ריאגנטים דומה הנדרש כדי לבנות מישורי bilayers תא הזרימה קונבנציונלי5 , יכול להיות מיושם בהצלחה לביצוע ההדמיה של תא T אנושי ראשוני – bilayer ממשקים3,4 ,15. הטכניקה מציע ירידה משמעותית השימוש מולקולות פלורס…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01AI118694 NIH מייקל ר’. בטס, כולל פרס תת 566950 יורי Sykulev. אנו מודים סידני קימל סרטן מרכז Bioimaging משותפים המשאב עבור תמיכה מצוינת שלהם.

Materials

CD4 T cell isolation kit, human Miltenyl Biotec 130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human Miltenyl Biotec 130-096-495
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
DOGS NTA Avanti Polar Lipids 790528C
Biotinyl Cap PE Avanti Polar Lipids 870273C
Human Serum Albumin Octapharma USA NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4 ibidi 80608
Coverslips for sticky-Slides ibidi 10812
Bioptech FCS2 Chamber Bioptech 060319-2-03
anti-CD3 antibody Thermo Fisher Scientific 16-0037-81 OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC
anti- CD28 antibody Genetex GTX14664 9.3 clone
Casein Sigma C5890
Biotin-PEO4-NHS Thermo Fisher Scientific 21329
DMSO Sigma D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10238
Amersham Cy5 NHS Ester GE Life Science PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors Thermo Fisher Scientific V412020
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection ATCC 37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS Lonza 12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4 ATCC CRL1878 The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B Sigma-Aldrich C9142 Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.
MasterFlex tangential flow concentrator Cole-Parmer 77601-60 7592-40 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems Pall Laboratory FS002K10 OS010T12 FS005K10 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30210
Dialysis tubing Spectra/Por 131384
Papain from papaya latex Sigma P3125
mouse anti-human antibody against CD107a BD Bioscences 555798 Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves Fisher Scientific 19-014-539
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps Thermo Fisher Scientific 6320-0010
Streptavidin ProZyme SA10
Confocal microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table
TIRF microscope Andor Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software Molecular devices

References

  1. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  2. Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
  3. Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
  4. Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
  5. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
  6. Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
  7. Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
  8. Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
  9. Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
  10. Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
  11. Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
  12. Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  13. Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
  14. Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
  15. Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
  16. Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).

Play Video

Citer Cet Article
Steblyanko, M., Anikeeva, N., Buggert, M., Betts, M. R., Sykulev, Y. Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58143, doi:10.3791/58143 (2018).

View Video