这里描述的是一个协议, 用于标记内在表达的蛋白与荧光标记在人类诱导多潜能干细胞使用 CRISPR/Cas9。认定编辑细胞通过荧光活化细胞分选, 生成克隆细胞系。
提出了一种用于生成人类诱导的多能干细胞 (hiPSCs) 的协议, 该方法将内源蛋白融合到帧内 n-或 C 末端荧光标记中。原核 CRISPR/Cas9 系统 (聚簇定期 interspaced 短回文重复/CRISPR 相关 9) 可用于通过同源定向修复 (HDR) 将大型外源序列引入基因组基因座。为了达到预期的效果, 本协议采用了基于 ribonucleoprotein (RNP) 的方法, 其中野生型链球菌化脓Cas9 蛋白, 合成2部分导 RNA (gRNA), 捐赠者模板质粒通过穿孔。认定编辑细胞表达荧光标记蛋白是丰富的荧光活化细胞排序 (外地资产管制署)。然后生成克隆线, 并可对精确编辑结果进行分析。通过在兴趣基因基因组轨迹上引入荧光标记, 可以在内源调节控制下研究融合蛋白的亚细胞定位和动力学, 这是传统过度表达的关键改进系统。利用 hiPSCs 作为基因标记模型系统, 为研究 nontransformed 细胞中标记蛋白提供了机会。由于 hiPSCs 可以被区分成多种细胞类型, 这种方法提供了在各种等基因系细胞环境中创建和研究标记蛋白的机会。
使用基因组编辑策略, 特别是 CRISPR/Cas9, 研究细胞过程越来越容易接近和有价值的1,2,3,4,5,6,7. CRISPR/Cas9 的许多应用之一是引入 (通过同源定向修复 (HDR)) 的大型外源序列, 如 GFP 成特定基因组的基因座, 然后作为记者的活动的基因或蛋白质产品8.该技术可用于将荧光蛋白序列加入到内源开放阅读框架中, 由此产生的内在调节融合蛋白可用于可视化蛋白的亚细胞定位和动力学5 ,6,9,10,11。虽然内在标记的蛋白质提供了许多好处相比过度表达系统, 插入大序列到人类基因组是一个效率低下的过程, 通常要求选择或浓缩战略, 以获得细胞的数量, 可以容易地被学习5,12。
该协议描述了将荧光蛋白 (FP) 编码为理想基因组轨迹的 DNA 序列的插入。该协议包括设计和交付供体模板质粒, 和 ribonucleoprotein (RNP) 复合物 (野生型S 化脓Cas9 蛋白结合合成 CRISPR RNA (crRNA) 和反激活 crRNA (tracrRNA))。还描述了通过荧光活化细胞分选 (认定) 和克隆细胞线生成过程丰富的编辑细胞。到目前为止, 该方法已用于生成 hiPSC 线与 monoallelic 或 (很少) 双等位的绿色荧光蛋白 (GFP) 标签标签二十五蛋白代表主要细胞结构。这些努力所产生的经过编辑的细胞已被证实有预期的基因插入, 表达正确的本地化融合蛋白, 并保持干细胞和稳定的核型12 (和未发表的数据)。这种方法也被用来产生多个其他单一和双 (两个不同的蛋白质标记在同一细胞) 编辑的人口 hiPSCs (未发表的数据)。
人类 iPSCs 从一个健康的捐赠者被选择为这些基因组编辑的努力, 因为, 不同于许多常规细胞系, 他们是双, karyotypically 稳定, 不转化, 和增生。这些特性为研究基础细胞生物学和疾病建模提供了一个有吸引力的模型。此外, hiPSCs 的分化潜力提供了机会, 研究多个不同的血统和细胞类型平行的发展阶段, 使用等基因系细胞, 包括 organoids, 组织和 “疾病在一碟” 模型13 ,14,15。虽然这项协议是为 hiPSCs (世贸中心线) 开发的, 它可能是信息, 以发展的协议使用其他哺乳动物细胞线。
本文提出的在 hiPSCs 中产生内在调节荧光蛋白融合的方法是一种多功能而有力的方法, 用于生成基因编辑细胞系, 其应用范围从活细胞成像到各种功能研究, 以及 “疾病在菜 “模型使用患者衍生的 hiPSC 线13,14,15。虽然这种方法已经被用来引入大 FP 标记的 n-或 C 终点的内源蛋白, 它可能会被用来引入其他标记或小的基因改变模型或正确的疾病导致突变22,23.对于较小的插入, 可减小同源臂的大小, 但此方法中显示的一般编辑方法仍可能适用于24、25。虽然使用 hiPSCs 是强烈鼓励他们的巨大效用, 仔细优化, 这个协议可能会修改, 以编辑其他哺乳动物细胞线的基因组。
在确定一个对 FP 标记感兴趣的基因时, 成绩单丰度估计 (从微阵列或 RNA 序列数据) 是一个很好的起点, 用于评估是否表达了一个基因或异构体, 尽管成绩单水平并不总是与蛋白质水平。这里所描述的这种浓缩策略对于那些至少在细胞类型中表达良好的基因最有效。这个策略也成功地选择了融合, 显示有点和/或离散的本地化模式, 如 centrin, desmoplakin, 和桩蛋白的信号, 背景比是非常低的12,19。没有高度表达或仅在导数细胞类型中表达的基因可能需要额外的选择策略。
人类细胞系中使用的 crRNA 和供体模板质粒设计的起始点应该是人类参考基因组 (GRCh38)。因为不同细胞系的基因组在同一物种内可能不同, 而且由于 CRISPR/Cas9 是序列特异的, 所以识别细胞线特定的变体 (单核苷酸多态性或插入/删除 (indels)) 是非常有用的。这与参考基因组不同, 并将其纳入设计中。这确保 crRNAs 将与宿主基因组兼容, 捐赠者模板质粒同源臂将保留任何细胞线特定变种。建议的策略是在设计过程中将纯合变体纳入 crRNAs 和供体模板质粒同源臂。合并异型变体是可选的。下面讨论了用于大型撞击实验的特定试剂和此协议的其他关键考虑事项。
Cas9 蛋白
使用 Cas9 蛋白的主要好处是, 引入 Cas9 和 gRNA 作为 RNP 复合物, 表明核酸酶活动的持续时间与以质粒为基础的方法相比, Cas9 和 gRNA 的表达可能会持续数天并导致到更高的和非目标活动26,27。使用 Cas9 蛋白的另一个好处是它可以随时在细胞内进行切割。这与更传统的使用 Cas9 mRNA 或 Cas9/gRNA 质粒的方法形成对比, 需要转录, 翻译和蛋白质处理26,28。Wildtype 的化脓Cas9 蛋白现在可从许多商业来源获得。
指南 RNA
在主基因组29、30、31、32中, 有许多公开的工具可用于查找在所需的 FP 插入站点附近有零个或很少预测目标的 crRNA 目标。hdr 的效率和 hdr 结果的精确度在给定轨迹12中使用的 crRNA 目标之间有很大差异。因此, 建议每个轨迹测试几个 crRNAs (2-4 和最好在所需插入站点的 50 bp 内), 因为这可能会增加成功编辑实验的可能性。目前提供 gRNA 的可能性包括合成2部分 crRNA 和 tracrRNA, 合成单 gRNAs (sgRNAs),体外转录 sgRNAs, 或提供质粒的细胞表达 sgRNA 从 U6 启动子。该协议没有为高解裂活动进行优化。未修改的2部分 crRNA 和 tracrRNA (见材料表) 用于生成单等位的 FP 标记细胞线, 同时对细胞造成最小的潜在扰动。
供体模板质粒
由于捐助者模板质粒中提供的某些同源臂序列将在 hdr 事件期间纳入宿主基因组, 因此应引入 crRNA 识别点的突变, 以防止 Cas9 跟踪 hdr 后的进一步分裂。通常最简单的破坏性变化是改变 PAM 序列。由于某些非规范的 PAM 序列仍然可以被野生类型的化脓Cas9 识别, 所以最好避免使用 NGG、NAG 或33。当变异的同源臂, 避免非同义突变和引进稀有密码子。如果对 PAM 序列的同义变化是不可能的, 考虑做三同义点变异在种子区域 (10 bp 近到 pam) crRNA 结合站点。在5ʹ未翻译区域 (UTR) 进行这些更改时, 应格外小心, 因为这些区域可能包含重要的管理序列。咨询一个遗传保护数据库, 如 UCSC 基因组浏览器的比较基因组学轨道可以提供指导, 在这些情况下, 因为对非保守基地的变化可能比对高度保守的基础17的变化更好的耐受性。有时仅仅插入 FP 序列就足以扰乱 crRNA 绑定站点 (如图 1所示);但是, 应检查新追加的序列, 以 crRNA 绑定和 PAM 序列的持久性。
建议在 FP 和原生蛋白之间连接器氨基酸, 以保存融合蛋白34的功能。通常氨基酸链接器可以选择其特定的电荷或大小。如果一个与目标内源融合蛋白相似的设计的 cDNA 融合得到了很好的研究, 同样的链接器序列可以用于 CRISPR/Cas9 实验12,19。如果此类信息不可用, 则在12中也成功使用了诸如 GTSGGS 这样的短链接器。其他研究已经证明了成功与一个普通的小 3-氨基酸链接器序列的各种目标35。
转染和富集
许多商业上可利用的转染试剂是为向细胞输送某些类型的分子而制定的, 而电穿孔系统可用于提供各种尺寸、电荷和成分的试剂。除了作为一种常见的转染方法, 如 hiPSCs 的硬到染细胞, 电穿孔也带来的好处, 提供所有三组件的 CRISPR/Cas9-mediated FP 敲, 如本方法所述。在开发此方法 (未显示数据) 的情况下, 与其他商用试剂相比, 电穿孔被发现能产生最佳效果, 其他产品也用于 RNP 交付26、28、36.
使用此协议编辑 hiPSCs 时, 应特别注意确保在基因编辑过程前后对细胞进行温和处理, 以获得最佳细胞存活率和最小自发分化。特别地, 应根据可能的最大喷嘴 (130 µm)、低流速 (≤24µL/分钟)、无防腐剂鞘液 (如生理盐水、见材料表) 和低样本来调整干细胞的分类方法。压力 (10 psi)。而不是单细胞排序, 结果在干细胞的最佳生存能力, hiPSCs 丰富的多项分类和扩大作为一个群体, 以优化细胞活力和干细胞完整性。但是, 单个单元格排序可能适合于不太敏感的单元格类型。为了促进细胞的存活, 细胞在收获后不超过一小时就被恢复到培养中, 在整个分拣过程中保持室温。对于某些细胞类型, 在整个排序过程中, 通过在冰 (4°c) 上孵化细胞来增强细胞存活率。
FP 阳性细胞的大量扩张为在生成克隆线之前的融合蛋白定位的影像学分析提供了一个评估人群的机会。虽然结果丰富的细胞数量可能是足够的一些研究, 这些人群经常显示的 FP 信号的强度不同。孤立的克隆线有一致的信号 (图 3), 使它们更适合于功能性实验12。
克隆细胞线生成
在整个编辑和克隆线生成过程中, 监测细胞形态学是很重要的。hiPSC 在无饲养条件下生长的殖民地应该展示光滑的边缘和均匀, 包装好的中心12,18,19。应在不到5% 的培养中观察分化细胞。挑选单个的殖民地时, 选择那些表现良好的形态。在96井板块传代事件中, 检查无性系的形态, 并停止那些杂草丛生的, 因为这可能导致分化或者是基因不稳定的征兆。
克隆细胞系的生成允许精确编辑的基因确认, 这是重要的, 因为 Cas9-induced 双链断裂在基因组经常被修复不精确地尽管在所需的轨迹中加入了标记。先前所描述的 PCR 检测结果显示, 十个独特的基因组位点 (45%) 在目标位点的捐赠质粒骨干整合或 (很少) 随机在基因组12中累积。此外, 23% 的 GFP 阳性克隆 (n=177) 横跨十个独特的基因座被发现在或接近预期的 crRNA 切割地点在未加标签的等位基因, 最有可能由于 NHEJ12。这种遗传分析的许多克隆线 (100 克隆/编辑) 强调了基因验证的重要性, 这是不可能在一个细胞的人口, 因为 FP 表达和预期融合蛋白定位不保证精确编辑12.此外, 这些基于 PCR 的化验方法不能对富集的细胞进行任何确定性的检测, 在有意义的分析完成之前, 需要克隆线的产生。对插入的 FP 标记的基因确认和验证未经编辑的等位基因的遗传完整性 (在单基因型的克隆) 是必要的, 以确保精确编辑在目标的轨迹以外的标记表达。
使用这种方法 (未公布的数据), exome 了低的双位基因编辑和缺乏非目标突变 (如由桑格和测序法测定).这与以前的研究描述的 CRISPR/Cas9 实验26,27的短期持久 RNP 的使用是一致的。缺乏双等位基因的克隆细胞系也可能是特定的轨迹, 或由于细胞无法容忍两个标记副本的基本蛋白质, 正如先前发表的实验所建议的, 假定双位基因编辑细胞是观察一个轨迹 (LMNB1), 但不是另一个 (TUBA1B)12。利用该方法对 ST6 β-半乳糖苷 alpha-2、6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1) 和 RAB5A19RAB5A 成员 RAS 癌基因家族 (mEGFP) 进行标记, 生成了双位基因完全验证的克隆细胞系。
除了确认基因组中的编辑精确度外, 还有各种各样的质量控制化验, 可用于进一步表征克隆线, 并确定完成所有干细胞、基因组和细胞生物学标准的克隆, 以供今后研究使用。.细胞生物学和功能分析可以用来确认适当的表达, 定位和功能的融合蛋白12。与未编辑的家长控制的比较将有助于评估编辑过程对本地化、动态和功能的影响。其他的化验, 如生长分析和基因组稳定性测试也可以帮助确定标记蛋白是否扰动细胞。在该协议中使用 hiPSC 时, 对干细胞标记和分化电位的评估对于确定一个对下游研究有价值的克隆是至关重要的12。由于 hiPSC 的延伸培养导致遗传不稳定性, 监测克隆细胞系的生长速率和核型也很重要,12,37。然而, 最终打算使用的编辑的细胞将最终决定质量控制分析的水平和广度, 并将根据应用的不同。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢达芙妮 Dambournet 为许多有见地的讨论和建议的基因编辑, 邵做插图, 安吉丽尼尔森的关键阅读手稿, 和安德鲁塔克生成 mEGFP 标签 Lamin B1 细胞线。我们希望感谢艾伦细胞科学研究所的干细胞和基因编辑和分析发展小组对基因编辑和质量控制过程的贡献。我们用来创建基因编辑细胞线的世贸中心线是由在旅行旅行学院和 UCSF 的布鲁斯 r. 康克林实验室提供的。我们感谢艾伦细胞科学研究所创始人保罗 g. 艾伦, 他的远见, 鼓励和支持。
Geneious R9 | Biomatters, or similar | bioinformatics software for in silico donor plasmid design | |
TE Buffer pH 8.0 | IDT, or similar | 11-01-02-05 | |
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar | ThermoFisher Scientific, or similar | 51030408 | |
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) | Rainin, or similar | ||
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) | Rainin, or similar | ||
Multi-channel Pipette (200 µL) | Rainin, or similar | ||
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) | Costar, or similar | ||
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable | Millipore Sigma, or similar | BR704526-1EA | use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below |
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 | Thermo Fisher, or similar | 3501-05 | |
XP2 Pipette Controller | Drummond, or similar | 4-000-501 | |
Disposable Pasteur Pipets | VWR, or similar | 53300-567 | |
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | CELLGARD, or similar | NU-481 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | lot tested before use with hiPSC |
DMEM/F12 (-phenol red) | Gibco | 11039-021 | cold, for diluting Matrigel 1:30 |
mTeSR1 Complete Media | StemCell Technologies | 85850 | recommended growth media for WTC hiPSC line |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
WTC hiPSC line | Coriell | GM25256 | the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell |
Tissue culture dish 100 mm | Falcon | 353003 | |
6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657160 | |
StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
15 mL polystyrene conical | Sarstedt | 62.554.100 | |
Y-27632 (ROCK Inhibitor) | StemCell Technologies | 72308 | |
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) | Dharmacon | Custom0247 | |
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA | Dharmacon | U-002005-05 | |
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM | University of California-Berkeley QB3 Macrolab | ||
Custom donor plasmid (PriorityGENE) | Genewiz | donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz | |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Clontech | 740424.50 | |
Neon Transfetion System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | |
Neon Transfection System, 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | |
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube | Falcon | 352196 | |
FACSAriaIII Fusion | BD Biosciences | 656700 | |
FACSDiva software | BD Biosciences | ||
FlowJo version 10.2 | TreeStar | ||
NERL Blood Bank Saline | ThermoFisher Scientific | 8504 | used as preservative-free FACS Buffer |
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar | Olympus, or similar | ||
Tissue culture plate, 96-well | Falcon | 353072 | |
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom | CELLSTAR | 351180 | |
CryoStor CS10 | Sigma | C2874-100ML | used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
24 well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 662160 |