Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit

Con los objetivos de eludir la infertilidad humana o mejorar la difusión de ganado de alto valor genético y preservar los recursos genéticos animales, un conjunto de técnicas colectivamente denominadas tecnologías de reproducción asistida, tales como la superovulación, en la fertilización vitro, la cultura embrionaria o la criopreservación, se desarrollaron^1,2. Actualmente, se administran tratamientos hormonales para estimular los ovarios y producir un gran número de folículos ováricos antrales¹. Los ovocitos recolectados de estos folículos se pueden madurar, fertilizar y desarrollar in vitro hasta que sean criopreservados o transferidos a madres sustitutas³. Sin embargo, durante estos tratamientos, los gametos y los cigotos están expuestos a una serie de procesos no fisiológicos que podrían requerir la adaptación del embrión para sobrevivir en estas condiciones^4,5. Esta adaptación es posible debido a la plasticidad embrionaria temprana, que permite cambios en los embriones en la expresión génica y la programación del desarrollo⁶. Sin embargo, estas modificaciones pueden influir en las etapas subsiguientes del desarrollo del embrión hasta la edad adulta, y ahora se acepta ampliamente que los métodos, el tiempo, el procedimiento de criopreservación o las condiciones de cultivo muestran diferentes resultados en el destino del embrión^{7 , 8}. por lo tanto, para dilucidar los efectos específicos inducidos de las artes, el uso de modelos animales bien caracterizados es inevitable.

El primer parto en vivo documentado resultante de la transferencia de embriones de mamíferos tuvo lugar en 1890⁹. Hoy, la transferencia de embriones (ET) a una hembra sustituta es un paso crucial en el estudio de los efectos inducidos por el arte durante la preimplantación en las siguientes etapas de desarrollo del embrión¹⁰. Las técnicas ET dependen del tamaño y la estructura anatómica de cada animal. En el caso de modelos animales de gran tamaño, ha sido posible realizar ET por técnicas no quirúrgicas ET transcervicales, pero en las especies de tamaño más pequeño el cateterismo del cuello uterino es más complejo y las técnicas quirúrgicas se utilizan con frecuencia¹¹. Sin embargo, la ET quirúrgica puede causar hemorragia que podría perjudicar la implantación y el desarrollo del embrión, ya que la sangre puede invadir el lumen uterino, causando la muerte del embrión¹⁰. Las técnicas transcervicales no quirúrgicas et se siguen aplicando en humanos, babuinos, bovinos, cerdos y ratones^{12,13,14,15,16,17}, pero quirúrgicos Los ETS se siguen utilizando en especies como cabras, ovejas u otros animales que presentan dificultades adicionales^{10,18,19,20,21}, como conejos (dos cervices independientes) o ratones (tamaño pequeño). Sin embargo, los métodos de transferencia quirúrgica tienden a haber sido reemplazados gradualmente por métodos menos invasivos. La endoscopia se utilizó para transferir embriones, por ejemplo, en conejos, cerdos y pequeños rumiantes^18,19,20. Estos métodos de endoscopia mínimamente invasivas se pueden utilizar para transferir embriones a la ampolla a través del infundibulum, que es esencial en los conejos y ha demostrado efectos beneficiosos en algunas especies²⁰. Esto se basa en la importancia del diálogo correcto entre el embrión y la madre durante las etapas tempranas del embrión en el oviducto. Como se mencionó anteriormente, la remodelación del embrión que tiene lugar en conejos durante la migración de embriones a través del oviducto es esencial para lograr embriones capaces de implantar^22,23.

Los modelos animales de mayor tamaño, como el bovino, son interesantes porque las características bioquímicas y preimplantarias son similares a las de las especies humanas²⁴. Sin embargo, los animales grandes son demasiado caros de usar en los ensayos preliminares, y los roedores se consideran un modelo ideal (76% los organismos modelo son roedores) para la investigación de laboratorio²⁵. Sin embargo, el modelo de conejo ofrece algunas ventajas sobre los roedores en los estudios reproductivos, ya que algunos procesos biológicos reproductivos expuestos por los seres humanos son más similares en conejos que en los ratones. Los humanos y los conejos presentan una activación cronológica del genoma embrionario similar, la gastrulación y la estructura emocorial de la placenta. Además, el uso de conejos es posible conocer el momento exacto de la fertilización y las etapas del embarazo debido a su ovulación inducida²⁵. Los ciclos de vida del conejo son cortos, completando la gestación en 31 días y alcanzando la pubertad en aproximadamente 4-5 meses; el animal es fácil de manejar debido a su comportamiento dócil y no agresivo, y su mantenimiento es muy económico comparado con el gasto de animales más grandes. Por otra parte, es crucial mencionar que los conejos tienen un útero dúplex con dos cervixes independientes^11,25. Esto coloca al conejo en una posición preferencial, ya que los embriones de los diferentes grupos experimentales pueden transferirse al mismo animal, pero en un cuerno uterino diferente. Esto nos permite comparar ambos efectos experimentales, reduciendo el factor materno de los resultados.

En la actualidad, los métodos de ET no quirúrgicos no se utilizan en conejos. Algunos estudios realizados a finales de los años 90 utilizando una técnica transcervical et resultaron en tasas de entrega bajas que oscilan entre el 5,5% y el 20,0%^11,26 versus el 50-65% por métodos quirúrgicos, entre ellos el procedimiento de laparoscopia descrito por Besenfelder y Brem¹⁸. Las bajas tasas de éxito de estos métodos no quirúrgicos de ET en conejos coinciden con la falta de la remodelación necesaria del embrión en el oviducto, que se evita en la ET transcervical. Aquí, describimos un procedimiento de ET laparoscópica mínimamente invasivo eficaz utilizando conejos como un organismo modelo. Esta técnica proporciona un modelo para una mayor investigación reproductiva en animales grandes y humanos.

Debido a que los conejos tienen una ventana de tiempo particularmente estrecha para la implantación de embriones, la ET en esta especie requiere un alto grado de sincro entre la etapa de desarrollo del embrión en ET y el estado fisiológico del receptor²⁷. En algunos casos, después de un tratamiento reproductivo que ralentiza el desarrollo del embrión (como la cultura in vitro ) o altera la receptividad endometrial (como los tratamientos de superovulación), no hay ninguna sincronía entre el embrión y el útero materno. Estas situaciones pueden afectar negativamente al resultado. Para responder en estos contextos, describimos un protocolo de vitrificación de mórula de conejo eficaz que nos permite pausar, organizar y reanudar los experimentos. Este proceso es logísticamente deseable para los estudios reproductivos y nos da la capacidad para el almacenamiento a largo plazo de embriones, permitiendo su transporte. El procedimiento laparoscópico y las estrategias de criopreservación permiten una mejor planificación de los estudios con menos animales. Por lo tanto, nuestra metodología ofrece ventajas higiénicas y económicas y se ajusta al concepto de la 3Rs (sustitución, reducción y refinamiento) de la investigación animal con el objetivo declarado de mejorar el tratamiento humano de los animales experimentales. Así, con estos métodos, los conejos constituyen un organismo modelo ideal para los ensayos reproductivos in vivo .