नाभिक और Cytoskeleton के बीच यांत्रिक एकीकरण को मापने के लिए एक सीधा बल जांच
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम एक micropipette विधि का वर्णन करने के लिए सीधे एक जीवित कोशिका में नाभिक को नियंत्रित बल लागू होते हैं । यह परख परमाणु यांत्रिक गुणों के रहने वाले, अनुयाई सेल में पूछताछ की अनुमति देता है ।
Abstract
नाभिक के यांत्रिक गुणों कोशिकाओं में उत्पन्न यांत्रिक बलों के लिए अपनी प्रतिक्रिया का निर्धारण । क्योंकि नाभिक cytoskeleton के साथ आणविक निरंतर है, विधियों अनुयाई कोशिकाओं में अपने यांत्रिक व्यवहार की जांच करने के लिए आवश्यक हैं । यहां, हम एक उपकरण के रूप में प्रत्यक्ष बल जांच (DFP) पर चर्चा के लिए एक जीवित अनुयाई सेल में सीधे नाभिक को लागू करने के लिए बल । हम सक्शन के साथ परमाणु सतह के लिए एक संकीर्ण micropipette देते हैं । micropipette नाभिक से दूर अनुवाद किया है, जो ख़राब और अनुवाद करने के लिए नाभिक का कारण बनता है । जब बहाल करने के बल चूषण बल के बराबर है, नाभिक अलग और लोचदार आराम । क्योंकि सक्शन दबाव ठीक जाना जाता है, परमाणु सतह पर बल जाना जाता है । इस विधि से पता चला है कि नैनो पैमाने पर बलों ख़राब और अनुयाई कोशिकाओं में नाभिक का अनुवाद करने के लिए पर्याप्त हैं, और cytoskeletal तत्वों है कि नाभिक को ताकतों का विरोध करने के लिए सक्षम की पहचान की । DFP कोशिकाओं में परमाणु यांत्रिक गुणों के लिए सेलुलर और परमाणु घटकों के योगदान को काटना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
इस तरह के कैंसर के रूप में विकृतियों परमाणु आकार और1,2, जो आम तौर पर एक ‘ नाभिक3,4के ‘ नरम के साथ कर रहे है संरचना के लिए परिवर्तन शामिल है । यांत्रिक विकृति के लिए परमाणु प्रतिरोध आम तौर पर अलग नाभिक5के लिए एक बल लागू करने के द्वारा विशेषता है ।
कोशिकाओं में नाभिक आणविक रूप से Nucleoskeleton और cytoskeleton (LINC) जटिल6,7,8,9के लिंकर द्वारा cytoskeleton से जुड़ा है । एक परिणाम के रूप में, नाभिक यांत्रिक cytoskeleton के साथ एकीकृत है और, सेल के माध्यम से-बुनियाद आसंजन, extracellular मैट्रिक्स । यांत्रिक अनुयाई कोशिकाओं के अंदर नाभिक की जांच इस यांत्रिक एकीकरण में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । तरीकों नाभिक में हेरफेर करने के लिए जीवित कोशिकाओं micropipette आकांक्षा10,11, और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी12,13,14शामिल हैं । हम हाल ही में एक सीधा बल जांच (DFP) है कि एक जीवित अनुयाई सेल15में नाभिक पर सीधे यांत्रिक बलों लागू होता है वर्णित है ।
यहां, हम एक microinjection प्रणाली है कि सामांयतः एक अनुयाई सेल में नाभिक को एक ज्ञात, नैनो पैमाने पर यांत्रिक शक्ति लागू करने के लिए सूक्ष्म सुविधाओं में उपलब्ध है का उपयोग करने के लिए प्रक्रिया रूपरेखा । एक femtotip (०.५ µm व्यास micropipette टिप) घुड़सवार और एक ट्यूब द्वारा microinjection प्रणाली से जुड़ा है । टिप, एक ४५ ° संस्कृति पकवान की सतह के सापेक्ष कोण पर तैनात, परमाणु सतह से सटे तक कम है । ट्यूब तो काट दिया और वातावरण के लिए खोला है, जो परमाणु सतह पर एक नकारात्मक चूषण दबाव बनाता है और परमाणु सतह के खिलाफ micropipette टिप जवानों । micropipette टिप के अनुवाद के माध्यम से, नाभिक विकृत और अंततः है (लागू बल की भयावहता पर निर्भर करता है), micropipette से अलग । इस टुकड़ी तब होती है जब बहाल (विरोध) बलों, नाभिक और कोशिका द्वारा लागू, चूषण micropipette द्वारा आवेदन बल बराबर । विश्लेषण नाभिक के विस्थापन, लंबाई तनाव (समीकरण 1), या क्षेत्र तनाव (आंकड़ा 1a) को मापने के द्वारा किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
cytoskeleton के साथ नाभिक के यांत्रिक एकीकरण को मापने इस तरह के micropipette आकांक्षा16के रूप में सबसे मौजूदा तरीकों, के लिए एक चुनौती है, क्योंकि वे या तो पृथक नाभिक की आवश्यकता होती है (जहां नाभिक cytoskeleton से जोड़ा…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को NIH R01 EB014869 ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
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