测量细胞核与骨架间机械一体化的直接力探针
Summary
在本协议中, 我们描述了一种微方法, 直接将受控力应用于活细胞中的细胞核。这项化验允许审讯活体, 黏附细胞的核机械性质。
Abstract
原子核的力学性质决定了它对细胞中产生的机械力的反应。由于细胞核是细胞骨架的连续分子, 因此需要方法来探讨其在黏附细胞中的力学行为。在这里, 我们讨论直接力探针 (DFP) 作为一个工具, 以力量直接向细胞核在一个活生生的黏附细胞。我们用吸力将一个狭窄的微附着在核表面。微从原子核中被翻译出来, 使原子核变形和转化。当恢复力等于吸力时, 原子核分离, 弹性松弛。因为吸入压力是已知的, 核表面上的力是已知的。该方法表明, 纳米尺度力足以使粘附细胞中的细胞核变形和转化, 并确定骨架元素, 使得原子核能够抵抗力。DFP 可用于解剖细胞和核成分对活细胞核力学性能的贡献。
Introduction
如癌症等病症涉及对核形态和结构1,2的改变, 通常伴随着 “软化” 的核心3,4。对机械变形的核阻力一般是将力应用于孤立原子核5。
细胞核在细胞是分子连接到细胞骨架由 Nucleoskeleton 和细胞骨架 (林肯) 复杂6,7,8,9的链接器。因此, 细胞核是机械地与细胞骨架结合, 并通过细胞基质粘连, 细胞外基质。机械地探测黏附细胞内的细胞核可以提供对这种机械整合的洞察力。在活细胞中操纵细胞核的方法包括微吸入10、11和原子力显微镜12、13、14。我们最近描述了一个直接的力量探针 (DFP), 直接地应用机械力量在原子核在活黏附力细胞15。
在这里, 我们概述了使用显微注射系统的程序, 通常是在显微镜的设施, 以应用已知的, 纳米级的机械力直接到核在黏附细胞。femtotip (0.5 µm 直径微尖端) 安装并连接到微注射系统由一个管。尖端, 定位在45°角度相对于养殖皿的表面, 被降低, 直到相邻的核表面。管子然后被断开并且被打开对大气, 在核表面创造一个负吸力压力并且封印微尖端反对核表面。通过微尖端的翻译, 原子核变形, 最终 (取决于施加的力的大小), 脱离微。当由原子核和细胞施加的恢复力 (抵抗) 力等于微所施加的吸力时, 这种分离就会发生。分析可以通过测量原子核的位移、长度应变 (方程 1) 或区域应变 (图 1A) 来进行。
Protocol
1. 准备用于成像的细胞 注: 直接力探头 (DFP) 可用于任何粘附单元类型。在这里, NIH 3T3 小鼠成纤维细胞被用作该协议的模型细胞线。 培养 NIH 3T3 成纤维细胞在 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 补充10% 捐赠牛血清和1% 青霉素-链霉素在35毫米玻璃底部菜, 直到理想的融合。保持细胞在37°c 和 5% CO2。 一定要涂上所有35毫米玻璃底菜与5µg/毫升纤维连接蛋白 (或类?…
Representative Results
图 2A显示了 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞核的强迫。当微尖端被翻译成右侧时, 原子核会变形, 最终与微尖端分离。随着抽吸力的增加, 原子核的长度应变增加 (图 2B)。原子核的前缘 (微拉边) 形成核突起, 尾部边缘从原位置偏移。突起的长度远远大于尾部边缘位移 (图 2C), 表明细胞核与周围细胞质紧密结合。时间?…
Discussion
测量细胞核与细胞骨架的机械结合是目前大多数方法的挑战, 如微吸入16, 因为它们需要两个孤立的原子核 (在细胞核与骨架分离的地方) 或悬浮细胞中的细胞核 (如牵引力, 无细胞外力)。通过将双轴应变应用于附着在膜17、18的细胞中, 将力应用于细胞核;然而, 这种技术是有限的事实, 在原子核的力量是未知的。原子力显微镜 (AFM) 探针被?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 NIH R01 EB014869 的支持。
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
Citer Cet Article
Zhang, Q., Tamashunas, A. C., Lele, T. P. A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (137), e58038, doi:10.3791/58038 (2018).