N-glycans Raphanus sativus Cultivars 사용 PNGase H⁺ 에서 분석

식물에서 N-glycans 그린 관심 증가 최근 몇 년 동안, 이전 연구로 알레르기 성 응답^{1,2 유도할 수 있는 면역 cross-reactions의 N-glycans을 강조 표시} . 그것은 입증 되었습니다 이전 촉매 활동^3,4, 내열성 및 접는^5,6 또는 subcellular 지 방화 N-glycans 공장 glycoproteins에 영향을 미칠 수 있는 고 분 비⁷. Glycan 구조 그들의 각각 기능 연관, 위하여 N-glycans 먼저 해제 되어야 합니다 glycoproteins에서 화학적 또는 효소. N-및 O-glycans 방출에 대 한 고전적인 화학 방법은 β-제거, 알칼리 샘플 치료 borohydride alditol⁸를 가진 감소에 의해 동반입니다. 그러나,이 절차는 fluorophore로 하는 걸로 하 고 glycan 구조의 줄이는 끝에서 단 당 류 단위의 상당한 감퇴의 원인. 수산화 암모늄/탄산 치료에 따라 화학 deglycosylation는 또한 일반적으로 사용 되는 대체 방법⁹. 이러한 화학 릴리스 방법의 그대로 단백질 같은 대량 범위에 레이블이 없는 glycan 풀 펩 티 드 파편의 간섭 없이 대량 spectrometric 분석을 수 있는 성능이 저하 됩니다. 그러나, 이러한 방법의 한 가지 단점이 일반적인 탄수화물 구조 발견 식물¹⁰에서 α1, glycans-3-fucosylated N의 증가 저하 속도입니다. 또는, 펩 티 드를 사용 하 여 효소 분리 방법:N-glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) 또한 광범위 하 게 적용 됩니다. 재조합 PNGase F ( Flavobacterium meningosepticum)에서 가장 일반적인 선택 하 고 N-glycans, 코어 α1, fucose 3^11,12베어링 구조를 제외 하 고 모든 종류의 릴리스 합니다. 따라서, PNGase A (아몬드 씨에서 분리)으로 식물 N-glycans¹³의 분석을 위해 사용 됩니다. 그러나,이 효소 deglycosylates만 proteolytically-파생 된 glycopeptides, deglycosylate 기본 glycoproteins¹⁴수입니다. 따라서, 다단계 샘플 검사 결과 추가 분석, glycans, 특히 낮은 풍부¹⁵의 그의 광범위 한 손실이 발생 하기 전에 필요 합니다. N-glycan 릴리스 및 형광 간단 하 고 강력한 방식으로 라벨에 대 한 최적화 된 워크플로우를 제시 하는 방법의 전반적인 목표가입니다. 기본 근거 PNGase H⁺는 Terriglobus roseus 에서 최근에 발견 되었다 recombinantly 대장균에 표현 될 수 있다, N-glycans 산 성에서 단백질 비 계에서 직접은 수은 조건¹⁶. PNGase H⁺ 를 사용 하 여 대체 방법의 주요 장점은입니다 형광 라벨 반응 반응 버퍼^17,18를 변경 하지 않고 동일한 반응 관에서 수행할 수 있습니다. 간단한 준비 조건 및 낮은 풍부 oligosaccharides의 높은 복구 확인이 방법은 유용한 도구 Nglycans의 분석에. 이 프로토콜은 다양 한 식물 종에서 N-glycans의 분석에 적합 합니다.