Здесь мы представляем протокол, чтобы точная количественная оценка митохондриальной ДНК (мтДНК) метилирование. В этом протоколе мы описываем ферментативного пищеварения ДНК с BamHI в сочетании с bioinformatic анализа трубопровода, который может использоваться для избежания переоценки мтДНК метилирования уровней, вызванные вторичную структуру мтДНК.
Количественная оценка метилирование ДНК можно добиться, используя бисульфита последовательности, которая использует свойство бисульфит натрия для преобразования unmethylated цитозина в урацил, в контексте одноцепочечной ДНК. Гидросульфит последовательности могут быть направлены (с помощью ПЦР) или на весь геном и обеспечивает абсолютное количественная оценка метилирование цитозина в одной базой резолюцию. Учитывая особый характер ядерной – и митохондриальной ДНК, особенно в вторичной структуре, следует адаптации методов секвенирования бисульфита для расследования метилирование цитозина в митохондриальной ДНК. Вторичной и третичной структуры митохондриальной ДНК может действительно привести к бисульфита, секвенирование артефакты, ведущих к ложных срабатываний из-за неполной денатурации плохой доступ бисульфита одноцепочечной ДНК. Здесь мы описываем протокол, с помощью ферментативного пищеварения ДНК с BamHI в сочетании с конвейера bioinformatic анализ позволяет точную количественную оценку цитозина уровень метилирования в митохондриальной ДНК. Кроме того мы предоставляем руководства для проектирования бисульфита последовательности Праймеры для митохондриальной ДНК, во избежание ориентации нежелательных ядерной митохондриальной сегментов (NUMTs) вставляется в ядерный геном.
Митохондриального генома — это циркулярный, двунитевая структура приблизительно 16,5 кило base (КБ) долго, составляющих из тяжелых и легких strand. Митохондриального генома присутствует в нескольких копий внутри каждой клетки, матерински унаследовал и кодирует важные компоненты дыхательной цепи комплексы1. Аналогичные, бактериальных геномов и в отличие от ядерного генома, митохондриального генома организована в многочисленных вторичной и третичной структуры, такие как спиральный и supercoiled структур2, который может затруднить доступ во время виртуализации 3эксперименты.
В ядре метилирование ДНК является широко изучены эпигеномные Марк, который играет роль в многочисленных процессах, особенно в регуляции экспрессии генов. В млекопитающих геномов метилирование ДНК происходит главным образом на положении 5 пиримидина кольцо deoxycytidines, главным образом на CG dinucleotides (или CpG). Метилирование цитозина находится на 70% всех ВПУ в геном соматических клеток и составляет ~ 1% от общего числа ДНК баз4. Methylations ДНК также был описан в не CpG контекстах, например, КПД, КПП и КПК и существуют в различных количествах в ядерной ДНК, значениями до 25% всех метилированные cytosines в эмбриональных стволовых клеток5,6,7.
Хотя широко признается, метилирование цитозина ядерного генома, существование митохондриальной ДНК (мтДНК) метилирование остается спорным. Первое исследование следственный мтДНК метилирования была исполнена в культивируемых клеток, где легко обнаружен мтДНК метилирования, хотя на более низких уровнях, по сравнению с ядерной ДНК8. В клетках человека и мышиных метилирование митохондриальной ДНК был также обнаружен при низких уровнях (2-5%). С помощью анализов, полагаясь на 5 обнаружен захвата таких метилированной ДНК иммунопреципитации (МЕДИП) следуют количественного PCR, метилирование митохондриальной ДНК был также обнаружен в различных человека и мыши и клеток линии9,10, 11,12. Использование антител против 5-метилцитозин анализа ELISA или масс-спектрометрии, значительный уровень метилирования дна были обнаружены из очищенного митохондриальной фракций13,14,15, 16. Однако большинство анализов в рамках вышеупомянутых исследований используются методы, которые не были предназначены для обеспечения абсолютной количественная оценка метилирование ДНК в одной базой резолюцию.
Анализ метилирования ДНК количественные и резолютивной может быть достигнуто путем метод под названием «Гидросульфит виртуализации», которая использует свойство бисульфит натрия для преобразования unmethylated цитозина в урацила в одноцепочечной ДНК контекст17 . С помощью последовательности бисульфита, созвездие исследований было обнаружено присутствие метилирование цитозина на различных уровнях. Метилирование мтДНК в регионе D-петля, 12С или регионе 16S легко был обнаружен в человека18,19,20,21,,2223 и мыши24 тканей и клеток, однако, с интригующим изменчивости, 1-20% от общего cytosines различных исследований.
По сравнению с эти многочисленные исследования только несколько исследований, в том числе из нашей группы, оспаривает наличие мтДНК метилирования3,25,,2627 или сомнение биологической значимости очень низкий уровень мтДНК уровней (ниже 2%)28. Недавно мы сообщили наблюдения потенциальным бисульфит последовательности артефакт в целом митохондриальной бисульфита последовательность3. Мы предоставили доказательства того, что вторичная структура митохондриальной ДНК может привести к ложных срабатываний в бисульфит последовательности, тем самым переоценивать уровень метилирования. Здесь мы предоставляем протокол для предотвращения артефакт бисульфит-преобразования митохондриальной ДНК. Этот протокол использует простой ферментативного пищеварения ДНК нарушить мтДНК вторичных структур и разрешить полный доступ к бисульфита после бисульфита последовательность протокола. Кроме того мы предоставляем сопутствующие bioinformatic трубопровода для анализа бисульфита последовательности.
Здесь мы предоставляем бисульфит последовательность протокола, который специально предназначен для допросить мтДНК метилирования. Различия с бисульфит последовательность протоколов, используемых для геномной ДНК лежит в использования предварительного энзима ограничения шаг пищев…
The authors have nothing to disclose.
Основные метаболические научно-исследовательский центр Фонда Ново Нордиск является независимый исследовательский центр в университете Копенгагена, частично финансируется неограниченного пожертвование от Фонда Ново Нордиск.
BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |