ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論
Summary
ここでは、ミトコンドリア DNA (mtDNA) のメチル化の定量の正確さを許可するプロトコルを提案する.このプロトコルではミトコンドリア Dna の二次構造によって引き起こされるミトコンドリア Dna のメチル化レベルの過大評価を避けるために使用することができますバイオ情報解析パイプラインと相まって病原が付いている DNA の酵素消化をについて説明します。
Abstract
DNA のメチル化の定量は、重亜硫酸塩の配列は、非メチル化シトシンとウラシル一本鎖 DNA のコンテキストでを変換するナトリウムの重亜硫酸塩のプロパティを活用を使用して達成することができます。重亜硫酸塩の配列をすることができます (PCR を使用して) を対象とした全ゲノム上で実行やシトシンのメチル化を単一ベース解像度の絶対定量を提供します。特に二次構造の核およびミトコンドリア DNA の異なる性質を考えると、ミトコンドリア Dna のシトシンのメチル化を調査するための重亜硫酸塩の配列方法の adaptions が行われなければなりません。MtDNA の二次および第三構造は確かに不完全な変性の単一座礁させた DNA を重亜硫酸塩のアクセスの悪さのため偽陽性につながる成果物を配列する重亜硫酸塩につながることができます。ここでは、シトシンの正確な定量化にミトコンドリア Dna のメチル化レベルを許可する DNA の酵素消化による病原バイオ情報解析パイプラインと相まってプロトコルについて述べる。加えて、我々 は mtDNA に固有重亜硫酸塩の配列のプライマーの設計のガイドラインを提供、望ましくない核ミトコンドリア セグメントをターゲットを避けるために (NUMTs) は、核ゲノムに挿入されました。
Introduction
ミトコンドリアのゲノムは約 16.5 キロ ベース (kb) の円形、二本鎖構造長い、重いと光の鎖を構成します。ミトコンドリアゲノムは母性継承、各セル内の複数のコピーに存在し、呼吸鎖複合体1の基本的なコンポーネントをエンコードします。同様に核ゲノムとは異なり、細菌のゲノムに、ミトコンドリアのゲノムは組織された多数の二次および第三構造などコイルとスーパーの構造2、アクセス困難なシーケンス処理中に表示することができます。実験3。
核内 DNA のメチル化、遺伝子発現の調節に特に多数のプロセスの役割を果たしている広範囲に研究エピジェネティックなマークです。哺乳類のゲノムの DNA のメチル化は deoxycytidines、主に CG ジヌクレオチド (CpG) のピリミジン環の 5 の位置に主に発生します。シトシンのメチル化は、DNA 塩基4体細胞と合計の ~ 1% のゲノムのすべての CpG の 70% で発見されます。DNA メチル化はまた公認会計士、CpT、クリック単価などの非 CpG のコンテキストに記載されているし、胚性幹細胞5,6,7ですべてのメチル化シトシンの 25% までの値と、核の DNA にさまざまな量で存在します。
核ゲノムのシトシンのメチル化は、広く、ミトコンドリア DNA (mtDNA) のメチル化の存在はまだ論争を呼びます。最初研究調査ミトコンドリア Dna メチル化は、核の DNA8と比較して低いレベルで培養細胞でミトコンドリア Dna のメチル化が検出されたで行われました。人間とマウスの細胞でミトコンドリア Dna のメチル化は低レベル (2-5%) も検出されました。メチル化 DNA 免疫沈降 (MeDIP) を定量的 PCR によって続いたなど 5 メチルシトシン キャプチャに頼るの試金を使用して、ミトコンドリア Dna メチル化様々 なマウスと人間にも認められた、細胞ライン9,10, 11,12。5-メチルシトシン ELISA の試金の質量に対する抗体を用いて、DNA のメチル化の実質的なレベルが検出された精製ミトコンドリア分画13,14,15,16します。 ただし、前述の調査の試金のほとんどは DNA メチル化を単一ベース解像度の絶対定量を提供するために設計されていない技術を使用します。
非メチル化シトシンとウラシル一本鎖 DNA コンテキスト17を変換するナトリウムの重亜硫酸塩のプロパティを活用する「重亜硫酸塩の配列」という手法により定量的および resolutive の DNA メチル化解析が可能します。.重亜硫酸塩の配列を使用して、研究の方角は、さまざまなレベルにおけるシトシンのメチル化の有無を検出しました。人間18,19,20,21,22,23マウス24で検出された 16S 領域や、12 D ループ領域のメチル化 mtDNA組織・細胞研究にわたって合計シトシンの 1 ~ 20% の魅力的な変動でただし、します。
これらの数多くの研究と比較して私たちのグループからを含むのみいくつかの研究がミトコンドリア Dna メチル化3,25,26,27の存在を論じられるまたはの生物学的妥当性を疑問視ミトコンドリア Dna (2%) 以下のレベル28の非常に低レベル。最近、ミトコンドリア全重亜硫酸塩の配列3の潜在的な重亜硫酸塩の配列項目の観測を報告しました。我々 はそれによりメチル化レベルを過大評価してミトコンドリア DNA の二次構造は重亜硫酸塩の配列で、偽陽性につながる証拠を提供しました。MtDNA の重亜硫酸塩の変換のアーティファクトを防ぐためにプロトコルを示します。このプロトコルは、ミトコンドリア Dna の二次構造を混乱させると次の重亜硫酸塩の配列プロトコルの重亜硫酸塩へのフル アクセスを許可する DNA の簡単な酵素の消化力を使用します。さらに、重亜硫酸塩の配列の解析に伴うバイオ情報パイプラインを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ミトコンドリア Dna のメチル化を尋問するとりわけ設計されている重亜硫酸塩シーケンス プロトコルを提供します。重亜硫酸塩の配列使用プロトコルの DNA との違いは NUMT シーケンスから偽陽性発生して事前の制限の酵素の消化手順とバイオ情報解析の活用にあります。
ミトコンドリア Dna メチル化を調査するとき、重亜硫酸塩の配列のアーティファクトを除?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ノボ ノルディスク基礎基本的な代謝研究センターは、ノボ ノルディスク財団から制限のない寄付によって部分的に資金を供給したコペンハーゲン大学で独立したセンターです。
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D’Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down’s syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -. M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. . Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. The BiSearch web server. BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
