نقدم هنا، وضع بروتوكول للسماح للقياس الكمي الدقيق من الميتوكوندريا الحمض النووي (متدنا) مثلايشن. في هذا البروتوكول، يصف لنا هضم الأنزيمي للحمض النووي مع بامهي مقترنة بخط أنابيب تحليل bioinformatic التي يمكن استخدامها لتجنب المبالغة في تقدير مستويات مثلايشن متدنا الناجم عن هيكل متدنا الثانوية.
التحديد الكمي للحمض النووي مثلايشن يمكن تحقيقه باستخدام تسلسل بيكبريتيت، الذي يستفيد من ممتلكات بيكبريتيت الصوديوم تحويل أونميثيلاتيد السيتوزين اليوراسيل، في سياق الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل. يمكن أن يكون تسلسل بيكبريتيت المستهدفة (باستخدام PCR) أو تنفيذها على الجينوم كله ويوفر الكمي المطلق مثلايشن السيتوزين في القاعدة-قرار واحد. نظراً للطابع المميز للحمض النووي–والميتوكوندريا، لا سيما في هيكل الثانوية، ينبغي أدابتيونس بيكبريتيت يسلسل طرق التحقيق مثلايشن السيتوزين في متدنا. هيكل التعليم الثانوي والعالي من متدنا يمكن أن يؤدي في الواقع إلى بيكبريتيت تسلسل القطع الأثرية المؤدية إلى إيجابيات كاذبة بسبب وصول الفقراء تمسخ ناقصة بيكبريتيت الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل. هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام هضم الأنزيمي للحامض النووي مع بامهي مقترنة بأنابيب تحليل بيوينفورماتيك للسماح بالقياس الكمي الدقيق من السيتوزين مستويات مثلايشن في متدنا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا توفير مبادئ توجيهية لتصميم كبسولة تفجير تسلسل بيكبريتيت محددة إلى متدنا، تفاديا لاستهداف شرائح “النووية المتقدرية” غير مرغوب فيها (نومتس) إدراج الجينوم النووي.
الجينوم المتقدرية بنية دائرية، مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل من حوالي 16.5-كيلو قاعدة (kb) منذ فترة طويلة، يشكل حبلا خفيفة وثقيلة. جينوم المتقدرية موجود في نسخ متعددة داخل كل خلية، الأمهات-الموروثة، وترميز المكونات الأساسية ل مجمعات سلسلة التنفس1. مماثلة للجينوم البكتيري وخلافا للجينوم النووي، الجينوم المتقدرية هو نظمت في عدة هياكل التعليم الثانوي والعالي، كما هو الحال في هياكل ملفوف وسوبيركويليد2، التي يمكن أن تجعل الوصول الصعب أثناء تسلسل 3من التجارب.
في النواة، مثلايشن من الحمض النووي هو علامة جينية درس على نطاق واسع أن يؤدي دوراً في عمليات عديدة، ولا سيما في تنظيم التعبير الجيني. في جينومات الثدييات، مثلايشن الحمض النووي يحدث أساسا في 5-موقف حلقة بيريميدين ديوكسيسيتيدينيس، معظمهم في دينوكليوتيديس الفريق الاستشاري (أو الدليل). يوجد مثلايشن السيتوزين في 70 في المائة من جميع البد في الجينوم من خلايا جسدية وحسابات ~ 1 في المائة من مجموع قواعد الحمض النووي4. ميثيليشنز الحمض النووي قد وصفت أيضا في سياقات غير المعبأة، مثل اتفاق السلام الشامل ولجنة مناهضة التعذيب، والحزب الشيوعي الصيني، وتوجد بكميات مختلفة في الحمض النووي، بقيم تصل إلى 25 في المائة من جميع سيتوسينيس ميثليته في الخلايا الجذعية الجنينية5،،من67.
بينما مثلايشن السيتوزين الجينوم النووي مقبول على نطاق واسع، وجود الميتوكوندريا الحمض النووي (متدنا) مثلايشن لا تزال مثيرة للجدل. مثلايشن متدنا التحقيق الأولى دراسة أجريت في الخلايا المستزرعة حيث سهولة تم اكتشاف مثلايشن متدنا، على الرغم من أن مستويات أدنى بالمقارنة مع الحمض النووي8. في الخلايا البشرية وموريني، اكتشفت أيضا مثلايشن متدنا عند مستويات منخفضة (2-5%). استخدام فحوصات الاعتماد على التقاط ميثيلسيتوسيني 5 مثل ميثليته الحمض النووي إيمونوبريسيبيتيشن (مدب) تليها PCR الكمي، مثلايشن متدنا واكتشفت أيضا في مختلف الماوس والإنسان وخلايا خطوط9،10، 11،12. استخدام الأجسام المضادة ضد 5-ميثيلسيتوسيني في تحليل إليزا أو الكتلي، تم الكشف عن مستويات كبيرة من الحمض النووي مثلايشن من الكسور المتقدرية المنقي13،،من1415، 16-ومع ذلك، يستخدم معظم فحوصات في الدراسات السالفة الذكر التقنيات التي لم تصمم لتقديم التقدير الكمي المطلق مثلايشن الحمض النووي في القاعدة واحدة-القرار.
تحليل كمي مثلايشن الحمض النووي يمكن أن يتحقق بأسلوب المسمى “بيكبريتيت التسلسل”، الذي يستفيد من ممتلكات بيكبريتيت الصوديوم تحويل أونميثيلاتيد السيتوزين اليوراسيل في واحد–الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي سياق17 . باستخدام تسلسل بيكبريتيت، كشف كوكبة من الدراسات عن وجود مثلايشن السيتوزين على مختلف المستويات. واكتشفت متدنا مثلايشن في منطقة د-حلقة أو 12S منطقة 16S سهولة في البشرية18،19،20،21،،من2223 والماوس24 الأنسجة والخلايا، ولكن مع التقلبات مثيرة للاهتمام، من 1-20% من مجموع سيتوسينيس عبر الدراسات.
بالمقارنة مع العديد من هذه الدراسات، المتنازع عليها وجود متدنا مثلايشن3،25،،من2627 سوى عدد قليل من الدراسات، بما في ذلك من مجموعتنا، أو يتشكك في صلة بيولوجية مستويات منخفضة جداً من متدنا مستويات (أقل من 2%)28. في الآونة الأخيرة، أبلغنا بمراقبة قطعة أثرية بيكبريتيت-تسلسل المحتملة في تسلسل بيكبريتيت المتقدرية كله3. وقدمنا الأدلة الثانوية بنية الحمض النووي يمكن أن تؤدي إلى إيجابيات كاذبة في تسلسل بيكبريتيت، يمثلهم وبالتالي مستويات مثلايشن. نحن نقدم هنا بروتوكولا لمنع قطعة أثرية من بيكبريتيت-تحويل متدنا. يستخدم هذا البروتوكول هضم الأنزيمي بسيطة من الحمض النووي لتعطيل الهياكل الثانوية متدنا والسماح بالوصول الكامل إلى بيكبريتيت عقب بيكبريتيت تسلسل بروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم خط أنابيب بيوينفورماتيك مصاحبة لتحليل تسلسل بيكبريتيت.
هنا، نحن نقدم بروتوكول بيكبريتيت التسلسل الذي تم تصميمه خصيصا لاستجواب مثلايشن متدنا. الخلافات مع بيكبريتيت-تسلسل البروتوكولات المستخدمة للحمض النووي يكمن في الاستفادة من خطوة سابقة تقييد إنزيم هضم وتحليل بيوينفورماتيك الحزب الحاكم من الإيجابية الكاذبة الناجمة عن تسلسل نومت.
<p class="jov…The authors have nothing to disclose.
نوفو نورديسك مؤسسة مركز أبحاث الأيض الأساسية مركز بحوث مستقلة في جامعة كوبنهاغن ممولة جزئيا من قبل منحة غير مقيد من مؤسسة نوفو نورديسك.
BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |