इमेजिंग सीए2 + उपकला कोशिकाओं के शिगेला संक्रमण के दौरान प्रतिक्रियाएं
Summary
यहां, हम मौजूद प्रोटोकॉल कैल्शियम कल्पना करने के लिए (Ca2 +) प्रतिक्रियाओं हेला द्वारा संक्रमित कोशिकाओं द्वारा प्रस्तुत शिगेला। बैक्टीरियल संक्रमण और2 + फ्लोरोसेंट जांच, असामान्य वैश्विक और स्थानीय सीए के साथ इमेजिंग के मापदंडों के अनुकूलन के द्वारा2 + संक्रमण कैनेटीक्स की एक बड़ी रेंज पर बैक्टीरिया द्वारा प्रेरित संकेत विशेषता हैं ।
Abstract
Ca2 + सभी ज्ञात सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल एक सर्वव्यापी आयन है । जबकि ग्लोबल ca2 + प्रतिक्रियाएं सेल भाग्य को प्रभावित कर सकते हैं, मुक्त ca2 + cytosolic सांद्रता में स्थानीय रूपांतरों, आंतरिक भंडार या प्लाज्मा झिल्ली चैनलों के माध्यम से एक आमद से जारी करने के लिए लिंक, cortical सेल प्रक्रियाओं को विनियमित । रोगज़नक़ों कि करने के लिए या आक्रमण मेजबान कोशिकाओं actin cytoskeleton के एक पुनर्गठन मेजबान प्लाज्मा झिल्ली अंतर्निहित है, जो संभावना दोनों वैश्विक और स्थानीय Ca2 + सिग्नलिंग प्रभावित करता है) ट्रिगर । क्योंकि इन घटनाओं में कम आवृत्तियों पर एक छद्म stochastic तरीके से विस्तारित कैनेटीक्स पर हो सकता है, Ca के विश्लेषण2 + रोगजनकों द्वारा प्रेरित संकेतों प्रमुख तकनीकी चुनौतियों है कि जरूरत को संबोधित कर उठाती है ।
यहां, हम वैश्विक और स्थानीय सीए का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट2 + उपकला कोशिकाओं के एक शिगेला संक्रमण पर संकेत. इन प्रोटोकॉल में, कलाकृतियों एक लंबे समय तक प्रदर्शन और Ca के उत्तेजना2 + फ्लोरोसेंट जांच के साथ जुड़े धूप से जुड़े एक के दौरान निर्धारित समय अवधि से अधिक इसरो अधिग्रहण मापदंडों को नियंत्रित करने से troubleshot है शिगेला आक्रमण. प्रक्रियाओं को कड़ाई से आयाम और वैश्विक cytosolic Ca की आवृत्ति का विश्लेषण करने के लिए लागू कर रहे हैं2 + सिग्नल विस्तारित संक्रमण के दौरान कैनेटीक्स रासायनिक जांच Fluo-4 का उपयोग कर.
Introduction
Ca2 + सभी ज्ञात सेल प्रक्रियाओं, cytoskeletal पुनर्गठन, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, और सेल मौत रास्ते मेजबान-रोगज़नक़ बातचीत1,2,3से संबंधित सहित नियंत्रित करता है । शारीरिक स्थितियों के तहत, बेसल cytosolic Ca2 + सांद्रता कम कर रहे हैं, एनएम रेंज के सैकड़ों में, लेकिन एगोनिस्ट उत्तेजना पर क्षणिक वृद्धि के अधीन किया जा सकता है । इन रूपों अक्सर पंपों और प्लाज्मा और endoplasmic जालिका झिल्ली पर चैनलों की कार्रवाई के माध्यम से थरथरानवाला व्यवहार दिखा । इन दोलनों के पैटर्न अवधि, अवधि, और ca के आयाम की विशेषता है2 + बढ़ाता है, और जो, बारी में, जो ca के रूप में जाना जाता है में विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए कोशिकाओं द्वारा डिक्रिप्ट किया जाता है2 + कोड4,5 . cytosolic Ca में निरंतर वृद्धि2 + रोग की स्थिति के तहत एकाग्रता mitochondrial झिल्ली के permeabilization के साथ जुड़े सेल मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और समर्थक अपोप्तोटिक या गल कारकों की रिहाई6, 7.
शिगेला, bacillary पेचिश के प्रेरणा का एजेंट, एक प्रकार III स्राव प्रणाली (T3SS)8,9का उपयोग कर मेजबान कोशिकाओं में प्रभाव इंजेक्शन द्वारा उपकला कोशिकाओं पर हमला । मेजबान कोशिकाओं के एक शिगेला आक्रमण स्थानीय और वैश्विक Ca के साथ जुड़ा हुआ है2 + संकेत T3SS द्वारा बटोरा । ताकना-बनाने विषाक्त पदार्थों के लिए के रूप में, T3SS translocon कि मेजबान सेल झिल्ली में आवेषण और T3SS प्रभाव के इंजेक्शन के लिए आवश्यक है पीएलसी और inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3) के सक्रियकरण के लिए जिंमेदार होने की संभावना है-निर्भर Ca2 + निर्गमन. स्थानीयकृत पीएलसी उत्तेजना का संयोजन और एक शिगेला आक्रमण परिणाम की साइटों पर एक असामान्य रूप से लंबे समय से स्थाई InsP3-निर्भर Ca2 + रिलीज10में पॉलिमर actin के संचय । प्रकार III प्रभाव IpgD, एक phosphatidyl 4, 5 bisphosphate (PIP2) -4-फॉस्फेट, PIP2 की स्थानीय राशि सीमा, इस तरह पीएलसी के लिए उपलब्ध सब्सट्रेट की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए InsP3 उत्पन्न करने के लिए, जो स्थानीय Ca की प्रसूति के लिए योगदान देता है2 + बैक्टीरियल आक्रमण साइटों पर प्रतिक्रियाएं11,12। इन स्थानीय Ca2 + प्रतिक्रियाएं संभावना actin बहुलकीकरण में शिगेला आक्रमण साइटों10में योगदान । ग्लोबल Ca2 + प्रतिक्रियाएं भी शिगेलाद्वारा निकाले जाते हैं, तथापि, जीवाणु आक्रमण प्रक्रिया के लिए औषधालय हैं, लेकिन प्लाज्मा झिल्ली पर connexin hemichannels के उद्घाटन और extracellular में एटीपी की रिहाई को ट्रिगर डिब्बे. एक paracrine तरीके से जारी एटीपी अभिनय, बारी में, संक्रमित कोशिका के बगल में कोशिकाओं में Ca2 + थरथरानवाला प्रतिक्रियाओं को उत्तेजित करता है । IpgD भी ग्लोबल Ca को आकार देने के लिए जिंमेदार है2 + प्रतिक्रियाओं धीमी गतिशीलता के साथ अनिश्चित अलग प्रतिक्रियाओं में । अंत में, एक लंबे समय तक जीवाणु संक्रमण पर, IpgD InsP3 की बाधा की ओर जाता है-मध्यस्थता Ca2 + संकेतों. सीए2 + संकेतन के साथ इसके हस्तक्षेप के माध्यम से, IpgD देरी एक ca2 +-निर्भर calpain सक्रियण फोकल आसंजन संरचनाओं के विधानसभा और संक्रमित कोशिकाओं13के समयपूर्व टुकड़ी के लिए अग्रणी ।
जबकि सीए2 + संकेत रोगजनन के महत्वपूर्ण पहलुओं में शामिल हैं, एक सूक्ष्मजीवों का उपयोग शास्त्रीय एगोनिस्ट अध्ययन में सामना नहीं कर रहे है कि तकनीकी चुनौतियों का एक नंबर उठाती है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित आमतौर पर इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट सीए2 + रासायनिक संकेतक Fluo-4 है कि हम एक शिगेला संक्रमण के दौरान स्थानीय सीए2 + संकेतों की विशेषताएं इंजीनियर । इन संकेतों का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण कदम पर चर्चा कर रहे हैं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अपने मात्रात्मक विश्लेषण है कि सीए में बैक्टीरियल effects की भूमिका की आवश्यकता है के लिए लागू प्रक्रियाओं2 + संकेतन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि प्रोटोकॉल है कि हम स्थानीय ca का पालन करें इंजीनियर का वर्णन2 + एक शिगेला आक्रमण के अपेक्षाकृत कम कैनेटीक्स के दौरान संकेतों, साथ ही साथ वैश्विक ca2 + प्रतिक्रियाएं शिगेलाकी विस…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम धंयवाद जेनी ली Thomassin पांडुलिपि संपादन में उसकी मदद के लिए । इस कार्य को ANR पलाश MITOPATHO और PATHIMMUN, पलाश से Labex Memolife और पीएसएल IDEX Shigaforce के सहयोग से किया गया । Chunhui सूर्य चीन छात्रवृत्ति परिषद से एक पीएच. डी अनुदान के एक प्राप्तकर्ता है । लौरेंत Combettes और गाइ ट्रॅन वान Nhieu एक WBI-फ़्रांस एक्सचेंज Tournesol प्रोग्राम के प्राप्तकर्ता है N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, शौकीन्स डे ला सभ्य Scientifique, Ministère Français des चक्कर étrangères एट européennes, Ministère डे l’Enseignement supérieur एट डे ला सभ्य लीए ले काडर देस Partenariats Hubert Curien).
Materials
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| Metamorph version 7.7 | Universal Imaging | ||
| CoolLED illumination system pE-2 | Roper Scientific | ||
| micro-dish 35 mm, high | IBIDI | 81156 | |
| Trypticase Soy (TCS) broth | Thermofisher | B11768 | |
| TCS agar | Thermofisher | B11043 | |
| Congo red | Sigma-Aldrich | 75768 | |
| M90T-AfaE | Sun et al. 2017 | Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin | |
| ipgD-AfaE | Sun et al. 2017 | isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin |
References
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