Summary

التصوير Ca2 + الردود خلال العدوى دوسنتاريا الخلايا الظهارية

Published: May 24, 2018
doi:

Summary

نقدم هنا، البروتوكولات تصور ردود الكالسيوم (Ca2 +) أثارت هيلا الخلايا المصابة دوسنتاريا. عن طريق تحسين معلمات العدوى البكتيرية والتصوير مع Ca2 + نيون تحقيقات، تتميز شاذة العالمية والمحلية Ca2 + إشارات الناجم عن البكتيريا على نطاق كبير من حركية العدوى.

Abstract

Ca2 + أيون في كل مكان في جميع العمليات الخلوية المعروفة. بينما Ca2 + الردود العالمية قد تؤثر على مصير الخلية، الاختلافات المحلية في الحرة Ca2 + سيتوسوليك التركيزات، مرتبطة بإطلاق سراح من المخازن الداخلية أو تدفق من خلال قنوات غشاء البلازما، وتنظم عمليات الخلية القشرية. مسببات الأمراض التي تلتزم أو غزو الخلايا المضيفة الزناد إعادة تنظيم cytoskeleton أكتين الكامنة وراء غشاء البلازما المضيف، الذي يحتمل يؤثر على العالمية والمحلية على السواء Ca2 + إشارات. نظراً لأن هذه الأحداث قد يحدث في الترددات المنخفضة بطريقة عشوائية الزائفة عبر حركية الموسعة، وتحليل Ca2 + إشارات الناجمة عن مسببات الأمراض يثير التحديات التقنية الرئيسية التي يتعين معالجتها.

هنا، نحن تقرير البروتوكولات للكشف عن العالمية والمحلية Ca2 + إشارات عند مرض دوسنتاريا الخلايا الظهارية. في هذه البروتوكولات، والتحف الفنية المرتبطة بتعرض لفترة طويلة ويتم troubleshot د المرتبطة بالإثارة من Ca2 + نيون المسابير بصرامة مراقبة لبارامترات على مدى فترات زمنية محددة خلال دوسنتاريا الغزو. وتنفذ إجراءات لدقة تحليل السعة والتردد العالمي سيتوسوليك Ca2 + إشارات خلال حركية العدوى الموسعة باستخدام مسبار الكيميائية فلوو-4.

Introduction

Ca2 + وينظم جميع عمليات الخلية المعروفة، بما في ذلك إعادة تنظيم سيتوسكيليتال والردود التحريضية ومسارات موت الخلية تتصل بالمضيف الممرض التفاعلات1،،من23. في ظل الظروف الفسيولوجية، القاعدية سيتوسوليك Ca2 + تركيزات متدنية، ومئات من شمال البحر الأبيض المتوسط المدى، ولكن يمكن إخضاعها للزيادات عابرة على تحفيز مؤثر. غالباً ما تظهر هذه الاختلافات السلوك متذبذبة من خلال عمل المضخات وقنوات في أغشية البلازما وهيولي. نمط هذه التذبذبات تتميز بهذه الفترة، والمدة، والسعة من Ca2 + الزيادات، ويتم فك تشفيرها بواسطة الخلايا التي، بدورها، تؤدي إلى استجابات محددة في ما يعرف باسم ال Ca2 + رمز4،5 . زيادة مطردة في Ca2 + تركيز سيتوسوليك في ظل الظروف المرضية قد تؤدي إلى موت الخلايا المرتبطة permeabilization أغشية الميتوكوندريا وإطلاق سراح برو–أبوبتوتيك أو، عوامل نخرية6 7.

دوسنتاريا، المسبّب للزحار العصوي، يغزو الخلايا الظهارية عن طريق حقن المستجيبة في الخلايا المضيفة باستخدام نوع الثالث إفراز نظام (T3SS)8،9. ويرتبط غزو دوسنتاريا بالخلايا المضيفة مع المحلية والعالمية Ca2 + إشارات T3SS. أما بالنسبة لتشكيل المسام السموم، ترانسلوكون T3SS أن يدخل في أغشية الخلايا المضيفة ومطلوب لحقن المستجيبة T3SS من المرجح المسؤولة عن تفعيل المجلس التشريعي الفلسطيني وتريسفوسفاتي inositol (1، 4، 5) (InsP3)–كاليفورنيا تعتمد2 + الإصدار. المزيج من تنشيط المجلس التشريعي المترجمة وتراكم أكتين مبلمرة في مواقع نتيجة غزو دوسنتاريا في يظهر طويلة الأمد تعتمد على InsP3 Ca2 + الإصدار10. المستجيب الثالث نوع إيبجد، بيسفوسفاتي الفوسفاتيديل 4، 5 (PIP2)-4-الفوسفاتيز، يحد من مقدار المحلية PIP2، وبالتالي السيطرة على كمية الركازة المتاحة للمجلس التشريعي الفلسطيني لتوليد InsP3، مما يسهم في حبس Ca المحلية2 + الردود على الغزو الجرثومي مواقع11،12. تسهم هذه Ca2 + الاستجابات المحلية المحتمل بلمرة الأكتين في دوسنتاريا غزو مواقع10. Ca2 + الردود العالمية التي أثارت أيضا دوسنتاريا, ومع ذلك، يمكن الاستغناء عنها لعملية الغزو البكتيري ولكن تؤدي إلى فتح هيميتشاننيلس كونيكسين في غشاء البلازما والإفراج عن ATP في الخلية حجرة. صدر ATP يتصرفون بطريقة paracrine، يحفز بدوره، Ca2 + متذبذبة الردود في الخلايا المجاورة للخلية المصابة. إيبجد أيضا المسؤولة عن تشكيل Ca2 + الردود العالمية إلى عدم انتظام الردود معزولة مع ديناميات بطيئة. في نهاية المطاف، على عدوى بكتيرية مطول، إيبجد يؤدي إلى تثبيط InsP3 بوساطة Ca2 + إشارات. من خلال تدخلها مع Ca2 + إشارات، يؤخر إيبجد Ca2 +-كالباين يعتمد التنشيط مما يؤدي إلى تفكيك هياكل التصاق المحورية والمفرزة سابقا لأوانه لإصابة خلايا13.

في حين تشارك Ca2 + إشارات في الجوانب الحرجة المرضية، استخدام الكائنات الدقيقة يثير عددا من التحديات التقنية التي لم تصادف في الدراسات الكلاسيكية مؤثر. استخدام البروتوكولات المذكورة هنا استخداماً الفلورسنت Ca2 + الكيميائية المؤشر فلوو-4 أن علينا إجراء هندسة عكسية لتوصيف Ca2 + إشارات المحلية أثناء مرض دوسنتاريا . وتناقش الخطوات الحاسمة للكشف عن هذه الإشارات، فضلا عن الإجراءات المنفذة للتحليل الكمي بما هو مطلوب لتوصيف دور المستجيبة البكتيرية في Ca2 + إشارات.

Protocol

1-الأعمال التحضيرية إعداد البكتيريا لوحة البكتيريا-دوسنتاريا السلالة البرية من نوع التعبير عن أدهيسين أف (M90T-أف) – على تريبتيكاسي أجار فول الصويا (TCS) لوحة تحتوي على أحمر الكونغو 0.01 ٪ (CR) واحتضانها لهم ح 18 عند 37 درجة مئوية.ملاحظة: لزيادة إمكانية تكرار نتائج بهم، لو…

Representative Results

غزو دوسنتاريا يرتبط شاذة طويلة الأمد Ca2 + الاستجابات المحلية: وبعد البروتوكول المذكور أعلاه، طعن خلايا هيلا فلوو-4-تحميل مع WT دوسنتاريا والمقتنيات تيار أجريت لتحليل Ca2 + إشارات. تجربة ممثل ويرد في الشكل 1…

Discussion

ويصف هذه المخطوطة البروتوكول الذي نحن هندسيا لمتابعة Ca2 + إشارات المحلية خلال حركية قصيرة نسبيا من غزو دوسنتاريا ، فضلا عن Ca2 + الردود العالمية خلال حركية موسعة من دوسنتاريا. أدناه، إشارات يمكن وجدت القضايا التي يلزم التصدي لها لتحسين الكشف عن Ca2 + المفتاح مع التق?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونشكر ثوماسين لي جيني ليساعدها في تحرير المخطوطة. وأيده العمل وكالة الاستخبارات الوطنية منح ميتوباثو وباثيمون، ومنح من ميموليفي لابيكس وفقدها أيدكس شيجافورسي. كوني الشمس هي المستفيدة منحة دكتوراه من “مجلس المنح الدراسية الصيني”. لوران كومبيتيس، والرجل تران فإن نيو يتلقون تبادل معهد البنك الدولي-فرنسا تورنيسول برنامج N ° 31268YG (والوني بروكسل “الدولي”، Fonds de la “البحث العلمي”، وزارة الفرنسي ديس افير خارجية et الأوروبية، دي وزارة التعليم العالي et de la البحوث dans le كادر قصر كيريان أوبير بارتينارياتس).

Materials

Fluo-4 AM Invitrogen F14201
Metamorph version 7.7 Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2 Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high  IBIDI 81156
Trypticase Soy (TCS) broth Thermofisher B11768
TCS agar Thermofisher B11043
Congo red Sigma-Aldrich 75768
M90T-AfaE Sun et al. 2017 Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE Sun et al. 2017 isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin

References

  1. Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
  2. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
  3. Strehler, E. E. Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2). Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).
  4. Muallem, S. Decoding Ca2+ signals: a question of timing. Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).
  5. Uhlen, P., Fritz, N. Biochemistry of calcium oscillations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).
  6. Carneiro, L. A., et al. Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells. Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).
  7. Horng, T. Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome. Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).
  8. Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells. Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).
  9. Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles. Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).
  10. Tran Van Nhieu, G., et al. Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion. Nature Communications. 4, 1567 (2013).
  11. Niebuhr, K., et al. Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology. The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).
  12. Konradt, C., et al. The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism. Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).
  13. Friedrich, P. The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).
  14. Thomas, D., et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
  15. Sun, C. H., et al. The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells. The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).
  16. Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus. Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).
check_url/fr/57728?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Smail, Y., Sun, C., Combettes, L., Tran Van Nhieu, G. Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (135), e57728, doi:10.3791/57728 (2018).

View Video