Summary

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Published: March 14, 2018
doi:

Summary

Este protocolo describe un método sencillo y conveniente para marcar y visualizar energizados cromosomas en las células mitotic usando la etiqueta Histone2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopia confocal spinning disc.

Abstract

Los cromosomas deben ser fiable y uniforme separados en células de la hija durante la división celular mitótica. Fidelidad de la segregación cromosómica es controlado por múltiples mecanismos que incluyen el eje montaje puesto de control (SAC). El saco es parte de un sistema complejo que es responsable para la prevención de un progreso de la célula por mitosis salvo los cinetocoros cromosómicos se han unido para huso de microtúbulos. Cromosomas anormales y retraso cromosómico segregación es un indicador de puntos de control de ciclo celular disfuncional y pueden utilizarse para medir la estabilidad genómica de dividir las células. Desregulación del saco puede resultar en la transformación de una célula normal en una célula maligna a través de la acumulación de errores en la segregación cromosómica. Implementación del saco y la formación de los cinetocoros complejo están estrictamente regulados por interacciones entre quinasas y fosfatasas como proteína fosfatasa 2A (PP2A). Este protocolo describe la proyección de imagen de células vivas de los cromosomas en fibroblastos embrionarios de ratón aislados de ratones que tenían un nocaut de la subunidad reguladora de la PP2A-B56γ del revestimiento. Este método supera las deficiencias de otros ciclo celular control técnicas de imagen como la citometría de flujo o inmunocitoquímica que sólo proporcionan una instantánea de un estado de citocinesis de la célula, en lugar de una visualización dinámica espaciotemporal de los cromosomas durante la mitosis.

Introduction

En el siguiente protocolo, describimos un método conveniente para visualizar la segregación cromosómica y la progresión mitótica durante el ciclo celular en fibroblastos embrionarios de ratón usando histona 2B-GFP, etiquetado BacMam 2.0 y proyección de imagen de células vivas.

Puestos de control de ciclo celular monitor segregación cromosómica y juegan un papel importante en el mantenimiento de la integridad genética de la célula 1,2,3. Acumulación de los cromosomas segregados mal puede llevar a aneuploidía, que es una característica de los tumores sólidos más 4. Por lo tanto, la detección de los cromosomas del revestimiento puede utilizarse como un método para el estudio de inestabilidad cromosómica.

Etiquetado fluorescente proteínas pueden ser utilizado para visualizar segregación cromosómica vivo y cromosomas rezagados pero la generación de etiquetas mCherry o proteína H2B-GFP etiquetado requiere conocimiento substancial del gene entrega y biología molecular 5. Aquí describimos el uso del reactivo de CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, regente de CL-HB, por simplicidad en lo sucesivo. Este reactivo puede utilizarse inmediatamente y elimina así las preocupaciones sobre la integridad y calidad de vector. Además, este reactivo no requiere el uso de tratamientos potencialmente dañinos o lípidos y productos químicos del colorante de carga. A diferencia de las etiquetas fluorescentes convencionales, el regente de la CL-HB manchas independientemente de la función (es decir., potencial de membrana). El regente CL-HB puede ser simplemente añadido a las células y se incubó toda la noche para la expresión de la proteína. El regente de la CL-HB no se replica en células de mamíferos y puede ser utilizado en la configuración de nivel de bioseguridad (BSL) 1 laboratorio. También, se puede detectar esta transfección transitoria después de la incubación durante la noche durante 5 días, tiempo suficiente para llevar a cabo análisis celulares más dinámico.

Por otra parte, anomalías cromosómicas podrían ser estudiados por varias técnicas como la citometría de flujo, inmunohistoquímica o fluorescencia in situ hibridación (pescado) 6. Citometría de flujo puede utilizarse para el estudio de la aneuploidía, que puede ser medido basado en contenido de ADN y la fase de células en ciclo celular. Aunque citometría de flujo puede utilizarse para medir aneuploidía, no proporciona información sobre segregación de errores cromosómica. PESCADO con técnicas de inmunohistoquímica utilizan sondas fluorescentes para obligar a ADN o los cromosomas. Mientras que estas técnicas proporcionan una instantánea de la situación de una población de células, no permiten el vivo de la célula de tal modo que falta cualquier información obtenida a través de la visualización espaciotemporal de citocinesis en células específicas durante un período de tiempo.

Este protocolo fue utilizado para estudiar los cromosomas de revestimiento o segregación errónea cromosómica en fibroblastos embrionarios de nocodazole tratado ratón (MEFs) aislado de PP2A-B56γ-ratones. Además de la anterior aplicación, este protocolo proporciona una herramienta sencilla para marcar y visualizar la segregación cromosómica en diversos tipos celulares que pueden utilizarse para estudiar la regulación del ciclo celular o inestabilidad cromosómica en las células del tumor. Además, también puede utilizado para el estudio de inestabilidad cromosómica causada por varios tratamientos con fármacos o para estudiar los efectos del gen golpee hacia fuera dando por resultado la segregación cromosómica de mal.

Protocol

Todos los experimentos llevados a cabo en estos estudios fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en el centro de investigación de alimentos y drogas (FDA). 1. aislamiento y cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) Aislar los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de una cepa de PP2A-B56γ-ratón y hermanos de camada de tipo salvaje por protocolo estándar 7,</sup…

Representative Results

MEFs de tipo salvaje y PP2A-B56γ-ratones fueron sembradas en un vidrio de cubierta de la cámara 2-bien y permitidos para fijar. En el día 2, MEFs se sincronizaron con 0.1% FBS para 24 h. El día 3, MEFs en medios con 200 ng/mL nocodazole y 30 regentwere de PPC CL-HB se incubaron durante 18 h a 37° C y 5% CO2. El día 4, las células fueron fotografiadas utilizando un sistema de microscopio confocal de disco giratorio (figura 1). En v…

Discussion

Puestos de control del ciclo celular que garanticen la segregación cromosómica precisa evitar aneuploide y celular transformación 1,2,3. En el presente estudio, encontramos que la inactivación de PP2A-B56γ resultó en un puesto de control de montaje de husillo debilitado. Celular directo imágenes nos permitieron observar la segregación errores cromosómica durante la mitosis en la MEFs de PP2A-B56γ tratados con nocodazol…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer al Dr. Guo-Chiuan Hung y Dr. Bharatkumar Joshi valiosos comentarios que mejoraron el manuscrito.

Materials

DMEM/F12 Gibco 11320082
L-Glutamine Gibco 25030081
MEM Non-Essential amino acids solution (100X) Gibco 11140050
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Dulbecco’s Phosphate Buffered saline Gibco 14190144
Trypsin-EDTA Gibco 25300054
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S11150
DMSO EMD Millipore MX 1458-6
Cryogenic vial storage boxes Fisherbrand 10-500-28
Cryogenic vials Corning/costar 431416
T75 flasks Cellstar 658175
2 well chambered cover glass Nunc 155380PK
Cellometer Vision Cell Profiler Nexcelom Bioscience LLC Cellometer Vision Trio
Nocodazole Sigma M1404
CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 Thermo Fisher Scientific Inc. C10594
Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system Carl Zeiss Microscopy Zeiss Cell Observer SD
Water Bath Thermoscientific 280 series
Incubator Sanyo commercial solutions MCO-18AIC (UV)
Class II Biological safety cabinet The Baker Company SterilGard
Axiovision software Zeiss Ver.4.8.2
ImageJ software National Institute of Health Ver. 1.51r

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Citer Cet Article
Varadkar, P., Takeda, K., McCright, B. Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis. J. Vis. Exp. (133), e57389, doi:10.3791/57389 (2018).

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