والهدف من هذا البروتوكول لإثبات حقن خلايا سرطان البروستاتا، مع عملية الاخصاء اللاحقة داخل البروستاتا. نماذج أورثوتوبيك قبل الإكلينيكية المعتمدة على الاندروجين والاخصاء مقاومة سرطان البروستاتا بالغة الأهمية لدراسة المرض في سياق ذات صلة سريرياً وورم المكروية ومضيف الأشخاص.
أورثوتوبيك الورم النمذجة أداة قيمة لأبحاث سرطان البروستاتا قبل الإكلينيكية، كما أن لديها مزايا متعددة على حد سواء تحت الجلد والمحورة وراثيا نماذج الماوس. على عكس أورام تحت الجلد، تحتوي الأورام أورثوتوبيك المفرج سريرياً أكثر دقة وورم المكروية، والاستجابات للعلاجات المتعددة. وفي المقابل إلى نماذج الماوس المهندسة وراثيا، أورثوتوبيك نماذج يمكن أن يؤديها بتكلفة أقل، وفي وقت أقل، تنطوي على استخدام الماوس معقدة للغاية وغير متجانسة أو خطوط خلايا السرطان البشرية، بدلاً من أن واحد التعديلات الوراثية، وهذه الخلية خطوط يمكن أن يكون وراثيا، مثل للتعبير عن وكلاء التصوير. نقدم هنا، بروتوكولا لحقن خط خلية سرطان البروستاتا مورين الإعراب عن لوسيفراس ومشري جراحيا في الفص البروستاتا الأمامي من الفئران. هذه الأورام أورثوتوبيك الفئران المتقدمة التي تم رصدها غير إينفاسيفيلي في فيفو وكذلك تحليل لحجم الورم والوزن، وبقاء الماوس وتسلل محصنة. علاوة على ذلك، الفئران الحاملة للورم أورثوتوبيك كانت جراحيا مخصي، مما يؤدي إلى تراجع الورم الفوري وتكرار اللاحقة، ويمثل سرطان البروستاتا المقاوم للخصي. بالرغم من المهارة التقنية القيام بهذا الإجراء، هذا النموذج أورثوتوبيك سينجينيك من سرطان البروستاتا المقاوم للخصي والمعتمدة على الاندروجين من فائدة كبيرة لجميع المحققين في الميدان.
ويقدر سرطان البروستاتا لديها أعلى معدل لانتشار (الرجال 161,360) وتتسبب في وفيات السرطان ثالث أهم الذكور (الرجال 84,590) في عام 20171. عند التشخيص، وأورام البروستاتا المعتمدة على الاندروجين، وتتم معاملتها بواسطة عملية استئصال غدة البروستاتا الجراحي، العلاج بالإشعاع، و/أو العلاج الاندروجين الحرمان (ADT)، بعد كل معاملة غير مقترنة مع متعددة مضاعفات والمراضات الكبرى2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10-وعلى الرغم من تراجع الورم بعد ADT، تتكرر ما يقرب من جميع الأورام كسرطان البروستاتا المقاوم للخصي (قانون الإجراءات الجنائية). وفي هذه المرحلة، تشمل العلاجات الموافق عليها دوسيتاكسيل، تي سيبوليوسيل المناعي، والجزيئات الصغيرة المضادة للالاندروجين انزالوتاميدي abiraterone، بعد العلاج الفردي لا يمنح فائدة البقاء على قيد الحياة لأكثر من11شهرا 5.2، 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17-ولذلك تحتاج الرجال في جميع مراحل الإصابة بسرطان البروستاتا خيارات تحسين العلاج وإدارة المراضات، لمرض ما قبل السريرية المثلى التي النمذجة أمر حاسم.
مع الإجراء الصحيح، يمكن أن تغرس خطوط خلايا سرطان البروستاتا جراحيا في البروستاتا مورين، مما يؤدي إلى تطوير أورام أورثوتوبيك سينجينيك أو إكسينوجينيك على حد سواء. النمذجة الورم أورثوتوبيك مثالي لكل ورم البيولوجيا والمخدرات بحوث التنمية، مما يسمح للتنمية الورم مع ممثل سريرياً وورم المكروية (TME). قد أثبتت الدراسات السابقة أن تحت الجلد (الليبي) الأورام المفرج غيرت ورم، مما يؤدي إلى استجابات سريرياً دقيقة التفاضلية وأقل للأوعية مكافحة العلاجات18،19. وبالإضافة إلى ذلك، دراسات متعددة قد لاحظ تزايد أو تناقص فعالية تشريعات متعددة في علاج نفس الخط الخليوي، اعتماداً على ما إذا كان يدير الليبي أو أورثوتوبيكالي، هذه الأخيرة التي تمثل أفضل ما يرى في الإنسان سرطان20،،من2122. علاوة على ذلك، فقط في نموذج أورثوتوبيك لسرطان القولون، ولكن ليس في النموذج الليبي، الأورام تنتج إنزيمات بوليمرات الصحيحة اللازمة لحمل خبيث23. وأخيراً، كما إيمونوثيرابيس تستمر في الظهور في طليعة علاج السرطان، وخاصة وأنها لم تقدم فائدة كبيرة لسرطان البروستاتا24،25، نماذج ما قبل السريرية سينجينيك مع TME دقيقة و تجفيف الغدد الليمفاوية في الأشخاص المضيفين الحاسمة.
هناك العديد من العوامل المسؤولة عن هذه النتائج غير متناسقة استناداً إلى موقع الورم. مع TME مختلفة، الخلايا السرطانية تتعرض لمختلف الأنسجة على حدة البطانة وغيرت الأوعية، مما يؤثر على الورم التنمية26،27. الأورام أورثوتوبيك مع TME الصحيح تسمح بإيصال الأدوية ذات الصلة سريرياً وظروف التاكسج، وتقييم العلاجات المضادة-الأوعية28. بينما تحتوي نماذج المهندسة وراثيا (الأحجار الكريمة) على TME دقيقة، أنها تتطلب فترة طويلة مرات لتربية وتكلفة عالية، وهي غالباً ما تستند إلى التلاعب الجينات واحد أو عدد قليل من خرج أو أوفيريكسبريسيد ما يتجاوز المستويات ذات الصلة سريرياً. وفي المقابل، خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية أو مورين المستخدمة في الأورام أورثوتوبيك، مثل الأورام البشرية، معقدة أكثر وراثيا سواء داخل خلايا مفردة أو في عرض عدم التجانس بين الخلايا29،30. أيضا خلافا للأحجار الكريمة، أورثوتوبيك سرطان الخلية خطوط يمكن إجراء هندسة عكسية للتعبير عن طرائق التصوير أو زيادة أو انخفاض مستويات جزيئات أخرى من الاهتمام، و في المختبر و في فيفو النتائج التجريبية يمكن مقارنتها مباشرة. يمكن أيضا أن تشكل الأورام أورثوتوبيك من الخلايا الأولية المستمدة من المريض. هنا، نحن التقرير منهجية إجراء الحقن داخل البروستاتا من خلايا سرطان البروستات التي تشكل أورثوتوبيك المعتمدة على الاندروجين الأورام، وبعد عملية الاخصاء، تتكرر أورثوتوبيك قانون الإجراءات الجنائية.
في هذه المخطوطة لنا الخطوط العريضة للبروتوكول للقيام بحقن خلايا سرطان البروستاتا داخل العمليات الجراحية. أننا استخدمت المعتمدة على الاندروجين و حركة-أوفيريكسبريسينج (يعتبرحركة overexpression يصل إلى 80-90% من سرطان البروستاتا البشرية39) خط خلية سرطان البروستاتا مورين، حركة الحد الأقصى، معزولة أصلاً من مرحبا-حركة الماوس32 ،33. وكان ترانسدوسيد هذا الخط خلية ستابلي للتعبير عن لوسيفراس ومتشيري، لغير الغازية في فيفو تصوير الورم طرحه ونيون، على التوالي. كما أنجز عملية الاخصاء الجراحي، وكذلك بعد التنمية المعتمدة على الاندروجين الورم، مما يؤدي إلى تراجع الورم وتكرار اللاحقة. ولذلك، نحن نقدم تفاصيل طراز أورثوتوبيك المعتمدة على الاندروجين سرطان البروستاتا وقانون الإجراءات الجنائية في مضيف الأشخاص.
تم حقن الخلايا الحد الأقصى لحركة الفص البروستاتا الأمامي من الفئران. البروستاتا الماوس يتكون من الفصوص البروستاتا الأمامي والبطني ودورسولاتيرال، والبروستاتا البشرية يتكون من المنطقة المحيطة والمنطقة الانتقالية، والمنطقة المركزية داخل فلقة واحدة40. في حين أن الدراسات السابقة قد تشريحيا والأشيع مقارنة الفص الماوس dorsolateral إلى الطرفية البشرية المنطقة، موقع غالبية41من سرطان البروستاتا، والفص الأمامي الماوس ل المنطقة المركزية البشرية42، 43، أثبت تحليل أكثر حديثة وشاملة أن الفص الأمامي والفص dorsolateral عرض أنماط تعبير الجينات ارتباطاً وثيقا، بالمقارنة مع الفص البطني. 44 أنه قد لوحظ كذلك، تطوير سرطان البروستاتا في الفص الأمامي من الأحجار الكريمة40، و للإجراء داخل البروستاتا، يسمح الفص الأمامي لحقن حجم سرطان الخلية الحل مع تسرب الحد الأدنى اللازم والتقلبات المناخية.
الليبي وجوهره المحورة وراثيا باستخدام نماذج السرطان لديها العديد من العيوب وأوجه القصور. أورام الليبي نمت في TME اصطناعية قد ردود التفاضلية على تشيموثيرابيس، وعلى النقيض من الأورام أورثوتوبيك كلا من نفس خطوط الخلايا والأمراض البشرية20،،من2122. قد يكون هذا بسبب المفرج غيرت الأورام الليبي، كما يتضح من استجابتها التفاضلية لمكافحة الأوعية العلاج18،19. على العكس من ذلك، أورام أورثوتوبيك تطوير مع TME سليم وتجفيف الغدد الليمفاوية والمفرج، ويمكن تنفيذها مع خطوط الخلايا مورين، يسمح ذلك أيضا لتحليل المناعة الورم والرد على إيمونوثيرابيس.
وضع الأحجار الكريمة المعدلة وراثيا الأورام مع TME سليم في مضيف الأشخاص، ومع ذلك تبسيط هذه النماذج عادة سرطان البشرية بتطوير أورام مع واحد أو عدد قليل من التعديلات الوراثية29. وكشف تحليل الحد الأقصى لحركة وخطوط خلايا سرطان البروستاتا الأخرى أنها تتضمن الكثير أكبر نسخة جسدية عدد التعديلات والتعديلات الصبغية من الأورام من الفئران مرحبا-حركة وغيره من الأحجار الكريمة التي كانت مشتقة29. علاوة على ذلك، تقتصر الأحجار الكريمة بزيادة التكلفة والوقت اللازم للفئران تربية للقيام بتجارب لطاقة كافية. النمذجة الورم أورثوتوبيك ويمكن التغلب على هذه القيود. خطوط خلايا سرطان البروستاتا البشرية ومورين تحتوي على العديد من التعديلات الوراثية ذات الصلة بالمرض البشري29، ومثل السرطان البشري، وتبين أيضا عدم تجانس كبير بين الخلايا الفردية30. الأورام سينجينيك مورين أورثوتوبيك تسمح للتحاليل المناعية، بينما أورثوتوبيك الأورام إكسينوجينيك البشرية تسمح لإجراء تحليلات للمداواة في الخلايا البشرية. أخيرا، على خلاف مع الأحجار الكريمة، الخلية يمكن تعديل خطوط قبل الحقن، مما يسمح للتعبير عن طرحه أو الفلورسنت التصوير الجزيئات لرصد نمو الورم، تطبيع العبء الورم بين المجموعات التجريبية، رصد استجابة للعلاج، وإلى تتبع الانحدار الورم وتجدد اللجنة بعد عملية الاخصاء الجراحي.
وتشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول تحديد مكان وتتستر حويصلة والمرفقة من الفص الأمامي البروستاتا دون الأضرار بالانسجة الأخرى أو ثقب حويصلة، القيام حقن داخل البروستاتا ناجحة من 30 ميليلتر من الخلية الوقف عن العمل دون التسرب، وجمع أي تسرب لمنع حدوث تطور الورم غير أورثوتوبيك في جميع أنحاء البطن بشكل صحيح. هو بلوغ الحد الرئيسية من الحقن داخل البروستاتا المهارة التقنية اللازمة للحد من تقلب ورم بين الفئران. وهذا مهم بشكل خاص للنمذجة قانون الإجراءات الجنائية، الذي قد أضاف متغير للخصي الجراحي. الفئران حقن داخل بروستاتيكالي ومخصي يجب أيضا أن يتابع عن كثب للانتعاش والأحداث السلبية، كما أنها قد تعرضت للعمليات الجراحية الكبرى بقاء اثنين. قيد آخر هو وقت كل الحقن داخل البروستاتا. ويمكن تخفيض هذا إلى منخفضة ك 20 دقيقة، والجراح مساعد يمكن إعداد الماوس التالية كما هو يجري خياطة الماوس الحالي. وأخيراً، الأورام أورثوتوبيك الحد الأقصى لحركة عدوانية، سريعة النمو الأورام التي تصل إلى نقطة النهاية بالبقاء على قيد الحياة في حوالي 46 يوما (وأقرب وقت 35 يوما) بسبب الورم الرئيسي الشامل. الدراسات التي تتطلب التنمية الورم أبطأ أو علاجات طويلة الأجل ينبغي أن يكون الأمثل تجريبيا لنظام العد ومعاملة خلية حقن الأولية. على النقيض من قيود الأورام الليبي والأحجار الكريمة، كل القيود المذكورة أعلاه نموذج الورم أورثوتوبيك يمكن التغلب عليها، ويمكن إجراء تعديلات إضافية للبروتوكول استناداً إلى الاحتياجات التجريبية الفردية.
كما أورثوتوبيك الورم نموذج ينطوي على استخدام في المختبر-التعامل مع الخلايا، وهذه الخلايا يمكن تعديلها تبعاً لاحتياجات الدراسة. وهنا، قمنا بتعديل هذه الخلايا للتعبير عن ستابلي لوسيفراس ومشري في فيفو رصد الورم. نحن أيضا بإجراء بالضربة قاضية Cas9 كريسبر القامع الورم، فتنلإنشاء خط خلية ذات الصلة سريرياً أكثر عدوانية، والتي تنمو أسرع كالأورام أورثوتوبيك (مخطوطة في الاستعراض). مع مزايا نموذج الورم أورثوتوبيك، والقدرة على دراسة سرطان البروستاتا المعتمدة على الاندروجين وقانون الإجراءات الجنائية، والقدرة على التعبير عن طرائق التصوير أو ضربة قاضية أو أوفيريكسبريس تحديد الجينات، وهذا البروتوكول بمثابة موردا قيماً للجميع أبحاث سرطان البروستاتا.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح برافين ثومبيكات (نيدك R01 DK094898)، وعبد القادر سركي (NCI R01 CA167966، CA123484 R01 NCI، NCI P50 CA180995) وجوناثان Anker (NCI F30 CA203472).
Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
RPMI | Gibco | 18875-093 | |
FBS | Gibco | 10437-028 | |
Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |