주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

녹 농 균 phenotypically 및 genotypically 다양 하 고 융통성 있는 그람 음성 박테리아 피부 microflora 뿐만 아니라 토양, 물, 그리고 가장 인간의 환경에 이다. 많은 세균성 종에 비해, P. 농 균 는 5.5-7 Mbp 콘텐츠 높은 G + c (65-67%)의 비교적 큰 게놈. 또한, 그것의 유전자의 상당한 비율이 변화 적응성에 참여 하 고 환경 스트레스¹에 응답에 큰 유연성을 허용 하는 규제 네트워크의 부분 이다. P. 녹 농 균 독성 요인의 과다를 표현, 양식 biofilms proclivity를 전시, 통해 경로 감지 하는 여러 개의 쿼럼 응답을 조정 하는 능력을 보유 하 고 및 항생제 저항을 개발 하는 주목할 만한 용량을 표시 그리고 허용 오차^{2,3,,45,6,7,8}. 이러한 특성 P. 녹 농 균에 한 감염 치료에 대 한 상당한 도전을 제시.

만성 피. 녹 농 균 감염 수많은 질병 상태에서 발생할 수 있습니다. 낭 성 섬유 증 (CF), 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 유전자의 돌연변이 의해 발생 하는 유전 질환 inspissated, 감염 된 분 비는 기도 내에서 결과 진보적인 기관지 확장 증 및 궁극적으로, 죽음 호흡기 장애⁹에서. 성인,으로 CF와 환자의 대다수는 피 녹 농 균, 병 적 상태와 사망률이 질병¹⁰와 관련 된 중요 한 역할을 만성 감염. 또한, 심한 화상 부상¹¹, tracheostomies¹², 공동 교체¹³또는 내재 카 테 터¹⁴ 환자 양식 하는 박테리아의 기능에 관련 된 피 녹 농 균 감염에 대 한 위험에 노출 되어 biofilms 및 탈출 선 동적인 응답¹⁵호스트. 또한, 식민 경쟁 없이 선택한 후 발생 합니다 다중 항생제 내성 또는 내성 인구는 넓, 순차 항균 치료^12,,1617 를 통해 ^{, 18}. 수많은 질병 상태에 대 한 중요 한 의미를 해야한다 더 나은 피 녹 농 균 의 병 인을 이해.

PAO1 PA103, PA14, 박세리, 종자를 포함 한 여러 피 농 균 임상 격리, 있다 P. 농 균 병의 다양 한 기능을 조사 하기 위해 광범위 하 게 연구 되었습니다. 긴장 PA14²⁰ 가장 일반적인 클론 그룹 전세계^19,중 하나에 속해 하 고 실험실에서 광범위 하 게 passaged 하지은 임상 분리 이다. PA14is 매우 주목할 만한 내과 감염의 척추 모델에 악성 프로²¹, pili 구조²², pathogenicity 제도²³, 유형 III 분 비 체계 (TTSS), 포유류 쪽으로 세포 독성 세포²⁴ 과 항생제 저항과 지 속성²⁵프로 파일. 또한, PA14 또한 매우 다양 한 호스트 병원 체 모델 시스템에서 악성, 식물 잎 등 침투 모델^26,27,꼬마 선 충 감염 모델^{28, 29}, 곤충^30,31, 모델 뿐 아니라 마우스 폐 렴 모델^32,33 및 피부 화상 모델³⁴.

게놈 넓은 돌연변이 라이브러리는 게놈 규모의 유전자 기능 분석을 함으로써 유 기체의 생물학을 이해 하는 매우 강력한 도구를 구성 하는 불필요 한 유전자에 있는 isogenic 돌연변이의 컬렉션입니다. 2 채도 근처 transposon 삽입 돌연변이 라이브러리 P. 녹 농 균 에 배포에 대 한 현재 사용할 수 있습니다. transposons의 삽입 사이트 두 라이브러리에 대 한 결정 되었습니다. 이러한 소위 비중복 라이브러리는 시간을 상당히 줄여 세균성 긴장의 게놈 넓은 연구를 촉진 하 고 비용에 관련 된 심사 새롭거나 임의의 transposon 돌연변이. P. 농 균 PAO1 transposon 돌연변이 라이브러리는 MPAO1에 스트레인 PAO1 transposons IS를 사용 하 여phoA/ 하 분리 이며lacZ/하³⁵, Manoil 연구소, 워싱턴 대학으로 큐레이터 이다. 시퀀스 확인 컬렉션 9,437 transposon 돌연변이의 게놈 넓은 범위를 제공 하 고 대부분 유전자³⁶두 돌연변이 포함 하는 도서관에 의하여 이루어져 있다. P. 농 균 PAO1 transposon 돌연변이 라이브러리에 대 한 정보 공개, 인터넷에서 액세스할 수 있는 Manoil 연구소 웹사이트 http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm에서 제공 됩니다. P. 농 균 스트레인 비중복 transposon 삽입 돌연변이 라이브러리 (PA14NR 설정) 스트레인 PA14 transposons MAR2xT7 및 테네시phoA를 사용 하 여³⁷ 에 현재 소아과의 부에 의해 배포 됩니다 PA14 매사 추세 츠 종합 병원. PA14NR 설정 불필요 한 유전자³⁷에 단일 transposon 삽입과 이상의 5800 돌연변이의 컬렉션으로 구성 됩니다. PA14NR 설정의 건설에 대 한 내용은 온라인 검색 도구는 PA14NR의 사용을 촉진 하는 다양 한 포함 공공, 인터넷에서 액세스할 수 있는 사이트 http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB에 설명 되어 있습니다. 설정 합니다.

원래 PA14NR 설정 5,459 돌연변이, 약 34000 임의의 transposon 삽입 돌연변이, 모든 예측된 PA14 유전자³⁷의 77%를 대표 하는 4,596 예측된 PA14 유전자에 해당 하는 포괄적인 라이브러리에서 선택한 구성. 2006 년에 도서관의 건설 이후 새로운 돌연변이 추가 되었습니다, 그리고 현재 약 4600 PA14 유전자를 나타내는 이상 5800 뮤턴트³⁸ 포함 PA14NR 설정. PA14 transposon 돌연변이의 대다수는 야생 타입 배경³⁷에서 생성 되었다. 유전적 배경를 포함 하 여 돌연변이 도서관의 각 구성원에 관한 자세한 사항은 온라인 데이터베이스 검색을 통해 또는 비중복 라이브러리 스프레드시트 (http:// PA14 웹 사이트에서 사용할 수 있는 두 기능을 다운로드 하 여 사용할 수 pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi)입니다. 돌연변이의 대다수는 MAR2xT7를 사용 하 여 만들어진 TnPhoA (phoA) transposon³⁷을 사용 하 여 만든 작은 세트 (MrT7) transposon. 각 transposon gentamicin (MrT7) 또는 대 (phoA)를 사용 하 여 돌연변이 선택할 수 있는 항생제 저항 카세트를, 있다. 돌연변이의 PA14NR 세트 63 96 잘 접시에 저장 되어 있는 야생 타입 PA14 이루어져 있는 접시, 주사 하는 두 개의 추가 96-잘 제어를 포함 하 고 사전 설정 된 패턴에 삽입 된 uninoculated 우물. 온라인 검색 도구와 크게 결합 96 잘 접시 형식 심사 분석 사용자가 돌연변이 고기와 관련 된 유전자를 쉽게 식별할 수 있도록 사용자 지정 개발을 촉진 한다. 온라인 검색 도구는 또한 검색 및 추가 연구에 필요한 추가 관련 돌연변이의 선택을 용이 하 게.

PA14 및 PAO1 transposon 돌연변이 라이브러리는 사회 과학에 대 한 매우 중요 한 전역 리소스 그리고 그들은 알 수 없는 유전자의 기능과이 세균성 병원 체의 경로 유효성 검사에서 서로 보완. 공교롭게도, PAO1 및 PA14 transposon 돌연변이 라이브러리의 건설 이후 많은 피 농 균 분리의 전체 게놈 DNA 시퀀싱 분석이 나타났습니다 PAO1와 PA14 피 녹 농 균의 다른 주요 subclades에 속한다 계통^7,39,,4041. 임상 P. 농 균 분리 하기 때문에 발견 계통, PAO1 및 PA14 다른 피 녹 농 균 에 속하는 사실 전역 배포 하위 비교에 대 한 두 개의 transposon 돌연변이 라이브러리의 가치를 향상 시킵니다. 연구입니다.

간행물 건축을 설명 하 고 세균성 돌연변이 라이브러리, P. 농 균 라이브러리^35,등의 상영^37,42, 문학에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리의 지식 최선을 아니 게시 프로토콜 설명 하는 자세한 절차와 기술을 복제, 사용 유지 보수 및 세균성 돌연변이 라이브러리의 유효성 검사 사용할 수 있습니다.

이 책에서 설명 하는 방법론 사용을 촉진 하는 세 가지 프로토콜의 집합 및 PA14NR 설정의 유지 관리에 설명 합니다. PA14NR 설정의 받는 사람에 게 권장 하는 대로 첫 번째 프로토콜 라이브러리의 복제를 설명 합니다. 두 번째 프로토콜 질주, 성장, 및 PA14NR 설정 사용 하 여 식별 하는 개별 돌연변이 저장에 대 한 지침을 포함 합니다. 세 번째 프로토콜 transposon 돌연변이에서 파편의 PCR 증폭 등 돌연변이 정체성을 확인 하는 후속 시퀀싱 품질 관리 기법을 설명 합니다. 프로토콜의이 세트는 복제 및 기타 세균성 돌연변이 라이브러리 또는 컬렉션의 유지 보수에 대 한 적응 하지 수도 있습니다. 세균성 돌연변이 라이브러리 또는 컬렉션의 복제 “마스터 복사”의 무결성을 유지 하기 위해 매우 좋습니다 (원래 사본을 받았다). 일상적인 실험실 사용을 위해 설정 하는 PA14NR의 여러 복사본의 복제 마스터 복사본의 interwell 오염의 가능성을 최소화합니다.