أسلوب لدراسة تعدد الأشكال C924T الجينات مستقبلات A2 ثرومبوكاني
Summary
في هذه الدراسة، ويمكننا وصف منهجية لتحليل النمط الوراثي C924T. البروتوكول يتكون من ثلاث مراحل: استخراج الحمض النووي، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وتحليل لتقييد يفتت طول التعدد (RFLP) على [اغروس] هلام.
Abstract
A2 ثرومبوكاني الجينات مستقبلات (TBXA2R) عضو فوق ز-البروتين إلى جانب عائلة مع المناطق السبعة transmembrane. أنها تشارك في تطور أثيروجينيسيس، الاسكيمية، واحتشاء عضلة القلب. نقدم هنا منهجية للمريض الوراثي التحقيق في دور تعدد الأشكال C924T (rs4523) التي تقع في المنطقة 3 ‘ الجينات مستقبلات TBXA2 بوستترانسكريبشونال. يعتمد هذا الأسلوب على استخراج الحمض النووي من الدم كله، بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) التضخيم جزء الجينات TBXA2 تحتوي على الطفرة C924T، وتحديد نوع البرية و/أو الأنماط الجينية متحولة استخدام تحليل خلاصة قيد، على وجه التحديد تقييد يفتت طول تعدد الأشكال (RFLP) على [اغروس] هلام. وباﻹضافة إلى ذلك، أكدت النتائج التسلسل الجيني TBXA2R. يتميز هذا الأسلوب بالعديد من المزايا المحتملة، مثل كفاءة عالية والتعرف السريع تعدد الأشكال C924T بتحليل PCR وإنزيم التقييد. ويسمح هذا النهج دراسة تنبؤية لتشكيل اللوحة، وتطور تصلب الشرايين من خلال تحليل الأنماط الجينية المريض لتعدد الأشكال TBXA2R C924T. تطبيق هذا الأسلوب لديه القدرة على التعرف على الأشخاص الذين هم أكثر عرضه لعمليات أثيروثرومبوتيك، في مواضيع معينة في مجموعة عالية الخطورة، والمعالجة بالاسبرين.
Introduction
TBXA2R هو عضو فوق ز-البروتين إلى جانب عائلة مع المناطق السبعة transmembrane، الذي أعرب على نطاق واسع والمترجمة في أغشية الخلايا أو في هياكل داخل الخلايا1،2. ويشارك في مسار الإشارات TBXA2R في عمليات تصلب الشرايين المتقدمة3. زيادة التعبير عن مستقبلات TBXA2 قد أظهرت خلال التقدم أثيروجينيسيس، والسريرية والدراسات التجريبية أظهرت بدورها ذات الصلة في الاسكيمية، واحتشاء عضلة القلب4. C924T، النوكليوتيدات واحدة تعدد الأشكال (SNP) من الجينات TBXA2R، اعترف تعدد الأشكال فنية في المتطوعين صحية وارتبط بالاضطرابات السريرية5. وعلاوة على ذلك، أظهرت لنا الدراسة السابقة6 أن تعدد الأشكال C924T TBXA2R الجينات متورطة في نسخة الاستقرار؛ وهناك على وجه التحديد، تزايد عدم استقرار من محضر نوع المسخ (TT) فيما يتعلق بنوع البرية (CC). وباﻹضافة إلى ذلك، المنبهات عدة مثل الادينوسين diphosphate (ADP) وادرينالين والكولاجين بتركيزات مختلفة المستحث تجميع الصفائح الدموية أقل فعالية لنوع المسخ (ترينيداد وتوباغو). وهذا يتسق مع تكوين خثرة المخفضة والارقاء. وبالتالي، عدم استقرار النسخة TBXA2R وتخفيض تراكم الصفائح الدموية المرتبطة بها قد تكون مقترنة بدور حماية للنمط الوراثي ترينيداد وتوباغو TBXA2R ضد أثيروثرومبوسيس ومضاعفاته شديدة الخطورة المرضى المعالجة بالاسبرين6 .
وهنا يصف لنا منهجية للمريض الوراثي للتحقيق في دور بوستترانسكريبشونال C924T تعدد الأشكال (rs4523) الواقعة في المنطقة 3 ‘ الجينات مستقبلات TBXA2. يعتمد هذا الأسلوب على الخطوات التالية: استخراج الحمض النووي (1) من الدم كله، (2) [بكر] تضخيم الجزء الجينات TBXA2R التي تحتوي على الطفرة C924T، و (3) تحديد نوع البرية و/أو الأنماط الجينية متحولة استخدام تقييد طول جزء تعدد الأشكال (RFLP) على [اغروس] هلام. رفلب هو أسلوب الذي يستغل الاختلافات في تسلسل الحمض النووي مثلى7. وكان استخدام هذا التطبيق للكشف عن الحمض النووي مجمع الأشكال المتعددة، لا سيما بطانات، وفي إيجاد والمنتسبين أهميتها البيولوجية في الاختلافات الوراثية8. وكان التعدد تحليلها للمرة الأولى باستخدام رفلب-PCR في البشر الدم أبو9. يسمح أسلوب RFLP PCR تحليل الطفرات الوراثية في تسلسل الحمض النووي مثلى بتقييم وجود شظايا من أطوال مختلفة بعد هضم الحمض النووي باستخدام اندونوكليسيس قيود محددة للغاية10.
في السنوات الماضية، المنهجيات التالية التي استخدمت لتحليل SNP استخدام تقنية PCR: التهجين قصيرة محددة اليل النوكليوتيد11، محددة اليل بكر12، تمديد التمهيدي على الحمض النووي [ميكروارس]13، ربط اليغنوكليوتيد الاعتداء14، “الحمض النووي مباشرة” التسلسل لتحديد الهوية الخاصة بموقف واحد-النوكليوتيدات مجمع الأشكال المتعددة15، تكمان الأسلوب16، استخراج (ماتريكساسيستيد الليزر الامتزاز/التأين وقت الطيران مالديتوف) الكتلي17و18من جينيتشيبس. هذه التقنيات ليست سهلة الاستعمال، وقد تتطلب معدات باهظة الثمن. على العكس من ذلك، طريقة PCR-RFLP غير مكلفة، وسهلة الاستخدام ومريحة، كفاءة عالية، ويتيح التعرف السريع على تعدد الأشكال C924T. وباﻹضافة إلى ذلك، أكدنا النتائج حسب تسلسل الجين TBXA2R استخدام الأسلوب سانجر15.
ويسمح هذا النهج دراسة تنبؤية لتشكيل اللوحة، وتطور تصلب الشرايين من خلال تحليل الأنماط الجينية المريض لتعدد الأشكال TBXA2R C924T. هذا الأسلوب يمكن تحديد مواضيع أكثر عرضه لعمليات أثيروثرومبوتيك، خاصة تلك التي بين المرضى المعرضة للخطر، والمعالجة بالاسبرين.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، التي وصفناها منهجية تسمح الوراثي المريض من أجل التحقيق في دور بوستترانسكريبشونال C924T تعدد الأشكال (rs4523) الواقعة في المنطقة 3 ‘ الجينات TBXA2R. أولاً، يعتمد هذا الأسلوب على استخراج الحمض النووي من الدم كله. على وجه الخصوص، تتكون هذه العملية الأولى لتنقية الحمض النووي البشري الإجمالية، الجينوم والميتوكوندريا، من عينات الدم كله الطازجة أو المجمدة، تعامل مع يدتا (سترات أو الهيبارين). للتخزين على المدى القصير من عينات الدم كله، تخزن في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 10 أيام. تخزين أكثر من 10 أيام، لتخزين العينات في-70 درجة مئوية. عملية تنقية الآلي تضم 4 خطوات: ليس وربط وتغسل والوت. ثانيا، الأسلوب يعتمد على [بكر] تضخيم الجزء الجينات TBXA2R التي تحتوي على الطفرة C924T. وأخيراً، يتم تحديد نوع البرية و/أو متحولة الوراثي استخدام تحليل إنزيم التقييد (RFLP) على [اغروس] هلام.
خطوات حاسمة في البروتوكول بما يلي: (ط) في حالة تخزين جزء من [اغروس] هلام في يستخدم RT، يمكن أن يكون [اغروس] طدت إعادة المذابة على حمام الماء المغلي (عند 60 درجة مئوية لحوالي 15-20 دقيقة) أو في فرن ميكروويف (3-5 دقائق) قبل صب. ملاحظة: فك الغطاء عند إعادة الصهر [اغروس] في زجاجة. (ثانيا)، وعلاوة على ذلك، عند إعادة تدفئة [اغروس]، التبخر سوف يسبب زيادة تركيزه. لهذا السبب، قد يكون من المفيد أن تعوض عن طريق إضافة كمية صغيرة من المياه. (ثالثا) شظايا من الحمض النووي أقل من 1000 شركة بريتيش بتروليوم تم تمييزه بواسطة [اغروس] هلام، وينصح TBE العازلة للحصول على فصل ممكن أفضل. (رابعا) أننا نفضل استخدام [اغروس] هلام بدلاً من جل polyacrylamide لأن إعداد هذا الأخير أكثر صعوبة، ويستغرق وقتاً أطول بكثير لإعداد. (ت) اختيار وقت تشغيل التفريد جل تعتمد على الحجم المتوقع لمنتجات التضخيم. وبناء على هذا البروتوكول، يكفي للقيام التفريد لمدة 20-30 دقيقة في 100 الخامس في 2% [اغروس] هلام، نظراً لحجم PCR شظايا يتراوح من 100-500 هناك (سادسا) أنها إلزامية للحصول على 10 إلى 50 نانوغرام قالب الحمض النووي المستخرج من عينات بشرية ذات نوعية جيدة . لهذا السبب، فإننا نفضل أن تستخدم تنقية الحمض النووي الآلي بدلاً من واحدة شبه تلقائي أو يدوي. (سابعا) إعداد حساب رد فعل مزيج الرئيسي للتضخيم بكر والحل الرئيسي–ميكس لهضم منتجات PCR، إضافة 10% أكثر (على حساب فقدان السائل أثناء بيبيتينج) لوحدة التخزين مضروباً في العدد العينات لوحدة التخزين المطلوب للحمض النووي عينة واحدة.
شرك الأكثر تكراراً للأسلوب هو وجود منتجات التضخيم إضافي بسبب برنامج cycler حرارية غير صحيحة، إعداد مزيج ماجستير تضخيم غير صحيحة، أو تلوث قالب الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، قد يكون عدم وجود منتجات PCR سبب المعطل [تق ] [بولمرس] أو cycler حرارية غير صحيحة تشغيل. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون وجود شظايا غير متوقع بسبب تلوث منتج PCR أو هضم غير مكتملة من إنزيم خامل أو المبلغ قليلاً جداً من حجم إنزيم التقييد، أو فترة حضانة قصيرة جداً.
في السنوات الماضية، استخدمت SNP التحليل باستخدام تقنية PCR المنهجيات التالية: التهجين قصيرة محددة اليل النوكليوتيد11، محددة اليل بكر12، تمديد التمهيدي على الحمض النووي [ميكروارس]13 ، ربط اليغنوكليوتيد الاعتداء14، مباشرة تسلسل الحمض النووي لتحديد هوية خاصة بموقف واحد-النوكليوتيدات مجمع الأشكال المتعددة15، تكمان الأسلوب16، استخراج ماتريكساسيستيد الليزر الامتزاز/التأين وقت الطيران (استخدام-TOF) الكتلي17، وجينيتشيبس18. هذه الأساليب ليست مثالية لأنها ليست بسيطة استخدام و/أو تتطلب معدات باهظة الثمن. على العكس من ذلك، بكر RFLP الطريقة الموضحة في هذه الدراسة غير مكلفة، وسهلة الاستخدام ومريحة، كفاءة عالية، ويتيح التعرف السريع على تعدد الأشكال C924T. وجود قيود على هذا الأسلوب أن فإنه يتم إلا لعدد صغير من بطانات وعينات قليلة في جلسة عمل.
للتطبيقات المستقبلية، يمكن استخدام هذا الأسلوب للدراسات التنبؤية بشأن تشكيل اللوحة وتطور تصلب الشرايين من خلال تحليل الأنماط الجينية المريض لتعدد الأشكال TBXA2R C924T. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يمكن تحديد مواضيع أكثر عرضه لعمليات أثيروثرومبوتيك، وعلى وجه الخصوص، علاج المرضى شديدة الخطورة مع الأسبرين. أخيرا، يمكن تطبيق هذا الأسلوب على دراسة أخرى تشارك في الطب شخصية للمخدرات محددة (على سبيل المثال، التخثر ومضادات الاختلاج) مجمع الأشكال المتعددة من أجل فهم الجرعة المناسبة من المخدرات والفرد الدوائي و الاستجابة السريرية لكل مريض قبل البدء في العلاج، وتجنب الآثار السلبية.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان تمويل هذا المشروع جزئيا بنسبة 60% اتينيو المنح من مينيستيرو ديل ‘ جامعة، إيطاليا إلى س. م.، وتي. كما تلقينا مساهمات جزئية البحوث نفقات الإدارة الطبية، وعن طريق الفم و “البيوتكنولوجية العلوم”، جامعة Chieti “زاي d’Annunzio”.
Materials
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10X buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \ |
References
- Shen, R. F., Tai, H. H. Thromboxanes: synthase and receptors. J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).
- Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene. J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).
- Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition. Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).
- Cipollone, F., et al. A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke. JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).
- Fontana, P., et al. Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers. Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).
- De Iuliis, V., et al. Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat. pii. (17), (2017).
- Saiki, R. K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).
- Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
- Lee, J. C. -. I., Chang, J. -. G. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).
- Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).
- Iwasaki, H., et al. Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides. DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).
- Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).
- O’Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays. Nucleic Acids Res. 30 (15), e75 (2002).
- Pickering, J. Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 30 (12), e60 (2002).
- Chatterjee, P. D. Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).
- Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5′ nuclease assay. Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).
- Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).
