Summary

Изоляция Брюшина производные тучных клеток и их функциональные характеристики с Ca2 +-изображений и дегрануляции анализов

Published: July 04, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол к изоляции и культивировать мышиных перитонеальных тучных клеток. Мы также обсудим два протокола для их функциональных характеристик: флуоресцентных изображений внутриклеточных бесплатно Ca2 + концентрации и пробирного дегрануляции основе колориметрические количественная оценка выпущенной β-hexosaminidase.

Abstract

Тучные клетки (MCs), как часть иммунной системы, играют ключевую роль в защите принимающей страны против нескольких возбудителей и в инициировании аллергических иммунного ответа. Активация MCs через cross-linking поверхности IgE связана с высоким сродством IgE рецептором (FcεRI), а также путем стимулирования несколько других рецепторов, инициирует подъем уровня свободного внутриклеточных Ca2 + ([Ca2 +]я) что способствует высвобождение медиаторов воспалительных и аллергических. Идентификация молекулярных компонентов, участвующих в этих сигнальных путей имеет решающее значение для понимания регулирования MC функции. В этой статье мы опишем протокол для изоляции типа МКН, перитонеальный лаваж мышиных соединительной ткани и культивирование перитонеальный MCs (ЧВК). Культур MCs от различных моделей мыши нокаут по этой методике представляют собой полезный подход к идентификации белков, участвующих в MC, сигнальные пути. Кроме того мы также описать протокол для одной ячейки фура-2 изображений как важный метод количественного определения Ca2 + сигнализации в MCs. флуоресценции основе мониторинга [Ca2 +]я является надежным и обычно используется подход к Изучите Ca2 + сигнализации событий, включая вход работает магазин кальция, который имеет первостепенное значение для MC активации. Для анализа MC дегрануляции мы описываем пробирного релиз β-hexosaminidase. Количество β-hexosaminidase, выпустила в среду культуры считается дегрануляции маркера для всех три различных секреторных подмножества описанных в MCs β-hexosaminidase могут быть легко количественно по его реакции с colorigenic субстрата в микротитровальных пластины колориметрического анализа. Этот высоко воспроизводимый метод с точки зрения затрат и не требует специализированного оборудования. В целом, предоставленный протокол демонстрирует высокий урожай МКН, выражая типичный MC поверхностных маркеров, отображение типичных морфологических и Фенотипические особенности MCs и демонстрирует высокую воспроизводимость ответы на secretagogues в Ca2 +– изображений и дегрануляции анализов.

Introduction

МКН играть заметную роль во время врожденного и приобретенного иммунного ответа. В частности MCs участвовать в убийстве патогенов, таких как бактерии и паразиты и также ухудшить потенциально токсичных эндогенного пептидов или компоненты яды (для обзора см. Галли et al. 20081). Физиологическая роль МКН в врожденная и адаптивного иммунитета является предметом оживленных дискуссий. Таким образом многочисленные расхождения данных в исследованиях, выполненных с различными моделями мышь MC-недостаточным требует систематической переоценки иммунологической функции помимо специальные2МКН. Зрелые MCs преимущественно локализуются в ткани и органы, такие, как кожи, легких и кишечника и обычно находятся только в небольших количествах в крови. MCs являются производными от кроветворных прекурсоров, таких как MC прародителями и завершить их дифференцировки и созревания в микросреды почти все васкуляризированной тканей1. Т-клеток, полученных фактор интерлейкина (IL) -3 выборочно способствует жизнеспособности, пролиферации и дифференцирования плюрипотентных населения мыши MCs от их гемопоэтических прародителями3. Стволовых клеток фактора (SCF) производится структурных клеток в тканях и играет решающую роль в развитии MC, выживания, миграции и функции4. Свойства отдельных MCs может отличаться в зависимости от их способность синтезировать и хранить различные протеазы или протеогликанов. В мышей так называемой соединительной ткани тип MCs отличаются от слизистой MCs согласно анатомической локализации, морфология и содержание гепарина и протеаз5.

В MCs, увеличение свободной цитозольной Ca2 + ([Ca2 +]я) является необходимым для дегрануляция и производства эйкозаноидов, а также для синтеза цитокинов и активация факторов транскрипции в ответ на антиген и различные secretagogues6. Главная задача течению этих стимулов — фосфолипаза C, который гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат диацилглицерол (DAG) и инозитол 1,4,5-trisphosphate. Даг активирует Протеинкиназа С и IP3 освобождает ионы Ca2 + от эндоплазматического ретикулума. Истощение этих магазинов активирует Ca2 + приток через плазматическую мембрану Ca2 + каналы, ведущие к хранить запись оперированных кальция (SOCE). Этот процесс вызвал путем взаимодействия Ca2 +-датчик, стромы взаимодействия молекулы-1 (Stim1), в эндоплазматический ретикулум с Orai17 , а также через активацию Переходный рецепторный потенциал канонические (Термизатор) канала белки (для обзора см. Freichel и др. 20148) в плазматической мембраны.

Для изучения физиологической роли этих каналов, несколько фармакологических (применение блокаторы кальциевых каналов) или генетические подходы обычно используются. В последнем случае, подавление экспрессии белка достигается путем ориентации мРНК (нокдаун) или геномной ДНК редактирования с глобальной или ткани конкретных9 исключить экзона кодирования поры, образуя Субблок канала (нокаут). Наличие окон с достаточной точностью для этих каналов является ограниченной. Кроме того, бросовым подход требует тщательного контроля ее эффективность с помощью, например., Западная пятно анализа и препятствует отсутствие специфических антител для целенаправленных канал протеина во многих случаях. Таким образом использование моделей мышей нокаут до сих пор рассматривается как золотой стандарт для такого анализа. Предпочтительным в vitro модель для исследования функций MC является выращивание ЧВК, которые могут быть изолированы ex vivo как полностью зрелые населения (в отличие от дифференциации МКН в vitro от, например., клетки костного мозга)10 . По сравнению с MCs костного производных (BMMCs), которые также часто используются для изучения MC функции в пробирке, стимуляция FcεRI и бета hexosaminidase релиз увеличивается спецавтотехнике и 100 раз в компании “ПМКС”, соответственно. В этой статье мы опишем способ изоляции и культивирование мышиных ЧВК, который позволяет получить после 2 недель культивирования большое количество чистого соединительной ткани типа МКН, достаточного для дальнейшего анализа.

Несмотря на недавний прогресс в разработке и применении показателей генетически закодированный кальция их использование по-прежнему ограничивается трудностями в доставке генов в клетки-мишени, конкретно, в весьма специализированных клеток, таких как основной культурный MCs. Кроме того эта группа Люминесцентные индикаторы для [Ca2 +]я измерений по-прежнему не хватает ratiometric красители с высоким динамическим диапазоном. По этим причинам предпочтительным методом для ratiometric [Ca2 +]я измерения по-прежнему является использование флуоресцентных красителей «Фура-2»11.

В настоящее время наиболее часто используемый подход для оценки MC активации и дегрануляции измерения β-hexosaminidase деятельности. Β-hexosaminidase, аллергических посредника, является одним из компонентов MC гранул, которые совместно выпущенные с гистамина в постоянной пропорции от MCs12. Β-hexosaminidase легко и точно измерять через его реакции с конкретного субстрата, который производит измеримые количество colorigenic продукт, который легко обнаружить в Гонав колориметрические assay. Сообщается, что в этой статье, применение этого метода для анализа ЧВК дегрануляции в ответ на различные стимулы.

Агрегирование высокоспецифичные рецепторы плазмалеммарного IgE (FcɛRI) активирует в MCs универсальный внутриклеточных сигнальный путь, приводит к высвобождению содержание секреторных гранул в окружающем пространстве внеклеточного. Помимо специфического антигена, многие другие раздражители могут активировать MCs выпустить разнообразных иммуномодулирующих посредников, таких как дополнение anaphylatoxins (например., C3a и С5а)13, эндотелина вазоконстриктора пептид 1 (ЭТ1)14 , а также многочисленные Катионный вещества и препараты, провоцируя pseudoallergic реакций (например., icatibant)15 путем привязки к MRGPRX216. Внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в MRGPR-индуцированной MCs дегрануляции характеризуются плохо по сравнению с FcɛRI опосредованной внутриклеточная сигнализация; Эти пути только начал интенсивно изучаться в течение последних нескольких лет17 после идентификации рецептор16. В основном каналы иона плазматической мембраны, участвующих в вход кальция, следуют MRGPRX2 стимуляции по-прежнему следует понимать. Таким образом настоящей статьи также фокусируется на сигнализацию внутриклеточного кальция и дегрануляции MCs стимулировали с агонисты MRGPR.

Protocol

Все животные процедуры выполнялись согласно немецкого законодательства руководящие принципы ухода и использования лабораторных животных (официально утверждена Карлсруэ регионального Совета). 1. PMC изоляции и культивирования внутрибрюшинного промывание <table fo:keep-together….

Representative Results

ЧВК были изолированы от 3 дикого типа мыши (C57BL/6Н), внутрибрюшинного промывание и далее культивировали в среде RPMI дополнены с FCS 20% и 1% перо-стрептококк в присутствии факторы роста (IL-3 на 10 нг/мл) и СКФ в 30 нг/мл в стерильных увлажняется условий на 37 ° C и 5% CO2. Средство б…

Discussion

MC модели могут успешно использоваться для изучения MC дегрануляции, хемотаксис, сцепления, а также разъяснению внутриклеточных сигнальных путей участвует в активации MC. Некоторые исследователи, использование человека MCs модели, такие как увековечена линии (LAD2 и HMC1) или человека MCs произ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы признать Julia Geminn для оказания технической помощи в подготовке тучных клеток и культивирования. Эта работа была поддержана трансрегиональных совместный исследовательский центр (TR-SFB) 152.

Materials

RPMI Medium Thermo Scientific 21875034
DPBS Sigma-Aldrich 14190144
FCS Thermo Scientific R92157
IL-3 R&D Systems 403-ML
SCF Thermo Scientific PMC2115
Concanavalin A Sigma-Aldrich C2272
Fura-2 AM  Thermo Fischer Scientific F1221
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
DNP-HSA  Sigma-Aldrich A6661
Anti-DNP-Antibody  Sigma-Aldrich D-8406
Penstrep Thermo Scientific 15140122
Compound 48/80  Sigma-Aldrich C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol Sigma-Aldrich X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside Sigma-Aldrich N9376
CoverWell Imaging Chamber Sigma-Aldrich GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom  Corning 3896
96-Well plates, flat bottom Greiner Bio-One 655180
Microtiter plate reader with "i-control" software  Tecan Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate  Greiner Bio-One 655180
Ionomycin Sigma-Aldrich I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes Sarstedt 62.547.254 
Culture Flasks (25 cm) Greiner Bio-One 69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 Menzel CB00250RA1
Hemocytometer VWR 631-0696
Inverted Microscope Zeiss Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil Zeiss 440260-9900
HC Filter Set Fura 2  AHF H76-521
CCD Camera Zeiss AxioCam MRm 
Monochromatic Light Source Sutter Instruments Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program Zeiss AxioVision 4.8.2 
Gravity fed solution application system Custom Made 4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes Sarstedt 62,554,502
Bench Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R

References

  1. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
  2. Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
  3. Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
  4. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
  5. Galli, S. J., et al. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
  6. Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
  7. Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
  8. Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
  9. Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
  10. Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
  11. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  12. Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
  13. Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
  14. Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
  15. Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
  16. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
  17. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  18. Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
  19. Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
  20. Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
  21. Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
  22. Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).

Play Video

Citer Cet Article
Tsvilovskyy, V., Solis-Lopez, A., Öhlenschläger, K., Freichel, M. Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays. J. Vis. Exp. (137), e57222, doi:10.3791/57222 (2018).

View Video