Summary

Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정

Published: February 27, 2018
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Summary

다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 에 기본 독성 요소 이며 크기 상관 스트레인 독성. 캡슐 직경 측정 phenotypic 테스트 및 치료 효능을 측정 하기 위해 사용 됩니다. 여기 캡슐 유도의 표준 방법을 제시 하 고 얼룩이 지 고 직경 측정의 두 가지 방법 비교.

Abstract

다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 의 기본 독성 요소 이며 가장 일반적으로이 병원 성 효 모의 측면을 공부. 캡슐 크기 긴장 사이 넓게 변화할 수 있다, 스트레스 또는 낮은 영양 조건에 도입 하는 때 급속 하 게 성장 수 있으며 변형 독성과 긍정적으로 상관 되었다. 이러한 이유로, 캡슐의 크기는 C. neoformans 연구자에 게 큰 관심입니다. C. neoformans 캡슐의 성장 phenotypic 테스트 하는 동안 긴장의 효 모 또는 크기 차이에 다른 처리의 효과 이해할 수 있도록 유도 된다. 여기 우리 캡슐 유도 및 비교 두 허용 방법 얼룩이 지 고 캡슐 직경 측정의 표준 방법 중 하나를 설명: (i) 인도 잉크, 부정적인 얼룩, 함께 기존의 가벼운 현미경 검사 법 및 (ii) 공동으로 얼룩에 사용 세포 벽 및 캡슐 뒤에 confocal 현미경 검사 법의 형광 페인트 마지막으로, 우리는 어떻게 인도 잉크 얼룩이 진 샘플에서 캡슐 직경의 측정 수 보여 전산 이미지 분석을 사용 하 여 자동화.

Introduction

매년 마다 분기 백만 사람들에 영향을 미치는 매년 180000 이상의 죽음의 결과로, Cryptococcus neoformans 이며, 세포내 병원 성 효 모 cryptococcosis1,2, 의 원인이 되는 대리인 3. 어려운 히트 하지 않은 항 레트로 바이러스 치료에 대 한 준비가 액세스 그들을 심하게 병4,,56에 감염 되기 쉬운 만드는 가난한 나라에서 HIV 양성 환자는. CDC에서 데이터는 사하라 사막 이남의 아프리카에서C. neoformans 죽이고 결핵 보다 더 많은 사람들이 매년 매달 기록1어떤 Ebola 발발 보다 더 나타냅니다. 노출의 가장 일반적인 경로 환경7평범 desiccated 포자를 흡입에서 발생 합니다. 입력 되 면 폐, 감염 된 개인에서 C. neoformans 의 성공에 기여 하는 여러 가지 독성 요인 있다. Acapsular 변종 악성8되지 않는 다 당 류 캡슐 미생물의 기본 독성 요인으로 간주 됩니다.

Cryptococcal 캡슐의 3 개의 원리 구성 요소를 만든: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), mannoproteins (MPs)9. MPs는 캡슐의 비교적 작은 세포 벽 관련 구성 요소, 면역성 이며 주로 프로 염증 반응을9,10를 홍보할 수 있습니다. GXM 및 GalXM 캡슐의 대부분을 확인 하는 반면, (> 90% 무게에 의해) 면역 효과11있다. 그것의 immunomodulatory 효과 이외에는 캡슐 vivo에서 의 급속 한 확대는 호스트 phagocytic 세포 (, 중 성구 및 대 식 세포)12섭취에 기계적인 장벽을 만듭니다. C. neoformans 캡슐과 그것의 종합은 복잡 하지만 전반적으로, 증가 캡슐 직경 증가 독성6,,1314와 상관 된다. 이 감안할 때, 신속 하 고 정확 하 게 계량 캡슐 측정 수 C. neoformans 연구에 대 한 중요 하다.

C. neoformans 세포와 그것의 다 당 류 캡슐 동적 구조 이며 시간15변화 표시. 캡슐은 밀도, 크기, 및 호스트 환경16,,1718의 변화에 대 한 응답에서 어셈블리에서 변경할 수 있습니다. 낮은 철 또는 영양 수준, 혈 청, 인간의 생리 적 pH를 증가 CO2 노출 캡슐 성장16,18,,1920를 시작으로 알려져 있습니다. 또한, 연구원은 보여주었다는 감염 시 immunoreactivity에 큰 차이가 발생 하는 구조적인 변화 대출 호스트 C. neoformans 를 이점을21,22. 이것은 C. neoformans 캡슐의 아키텍처는 다양 한 방법으로 분석 하기 때문에 알려져 있다. 전자 현미경 검사 법, 예를 들어 캡슐 외부, 더 투과 층23아래 내부 전자 밀도 레이어와 이기종 매트릭스는 계시 했다. 산란 및 광학 족집게를 사용 하 여 연구자의 고분자 속성24더 명료를 허용 했습니다. 둘 다 정적 및 동적 산란 측정에서 결과 분석, 우리는 알고 다 당 류 캡슐 복잡 한 분기 구조23있다. 광학 핀셋 구조 강성을 테스트 하 고 평가 하는 그것의 항 체 반응24사용 되었습니다. 그러나, 지금까지 가장 자주 고용된 분석 C. neoformans 캡슐의 그것의 크기의 측정 이다.

캡슐 크기 척도, 연구원은 간단한 측정 해야 사용: 캡슐의 선형 직경. 디지털 현미경 인도 잉크 또는 형광 염료와 스테인드 여러 C. neoformans 셀 (일반적으로 수백)의 이미지를 캡처하는 데 사용 됩니다. 각 셀 몸과 주변 캡슐의 크기 측정 됩니다. 데이터는 컴파일하고 캡슐의 평균 직경 (셀 바디 + 캡슐) 전체 셀 직경에서 세포 체 직경을 빼서 계산 됩니다. 이 시점까지이 측정 수행 되었습니다 수동으로. 그러나 일반적으로 정확 하 고, 연구자에 대 한이 메서드는 단점이 있습니다. 큰 데이터 집합 며칠이 걸릴 수 있습니다 또는 직접 분석 하는 주. 그리고 이러한 측정 수동으로 할 수 있습니다, 때문에 주관과 인간의 오류 영향을 미칠 수 결과.

자동화 된 컴퓨터 이미지 분석 생물 이미지 25,,2627의 더 빠르고 더 신뢰할 수 있는 분석을 사용 하는 분자 세포 생물학의 여러 분야에서 연구자 불가 결 한 도구가 되고있다. 정확한 이미지 분석 기법 무엇입니까 종종 복잡 하 고 거 대 한 데이터 집합에서 양적 정보 내 필요 하다. 그러나, 일부 측정, 특히 C. neoformans 캡슐의 측정을 자동화 하기 어려운 되었습니다. 정확 하 게 식별 하는 세포 벽과 캡슐, 일반적으로 어두운 링 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 군데 나타나는 간의 인터페이스 간단한 임계값을 사용 하 여 해결 성가신 될 수 있습니다. 또한, C. neoformans 세포 문화에 함께 덩어리 하는 경향이 셀의 정확한 세분화 정확한 측정을 위해 필요 합니다.

이 프로젝트의 목표는 (i) C. neoformans, (ii) 비교 및 대비 인도 잉크 캡슐 유도 대 한 표준 프로토콜 중 하나를 설명 했다 고 형광 얼룩으로 직경 측정 캡슐 관련 된 (iii) 개발 간단 하 고, 계산 방법 인도 잉크 얼룩이 이미지 분석 소프트웨어, (iv)를 사용 하 여 셀의 이미지를 사용 하 여 캡슐 직경을 측정 하는 이점 및 제한 수동으로 캡슐 직경을 측정 하 고 소프트웨어 자동화를 사용 하 여의 평가 합니다. 우리 두 착 방법, 형광 세포 벽 및 캡슐의 라벨의 찾을, 더 시간이 걸리는 반면, 실험 사이 가장 일관 된 결과 제공. 그러나 두 방법 모두 성공적으로 구별을 사용 하는, 실험실 및 임상 C. neoformans 사이 긴장 다른 전시 캡슐 크기. 또한, 우리는 인도 잉크 얼룩이 이미지에서에서 캡슐 직경의 측정을 자동화 하 고 이것은 캡슐의 수동 측정에 대안을 발견 수 있었다.

Protocol

참고: C. neoformans Biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체 이며 연구자 작업 적절 한 예방 조치를 취해야 합니다. 상세한 절차 어떻게에 안전 하 게 BSL-2 병원 체와 함께 작업에서 찾을 수 있습니다 중앙 질병 관리국 (CDC)에 웹사이트, 하지만 그것은 C. neoformans 의 접촉으로 오는 모든 사람 제대로 처리에서 훈련 되어야 한다 병원 성 대리인 및 적절 한 개인 보호 장비 (PPE), 일반적으로 라텍스 또는 니…

Representative Results

캡슐 유도, 세포 얼룩, 이미징, 및 측정 기법을 설명 하기 위해 사용 하는의 3 개의 긴장 C. neoformans: 일반적인, 잘 특징이 실험실 스트레인, H99S30및 2 개의 임상으로 고립 된 긴장의 이전 알 수 없는 캡슐 직경, B18, b 5231. 캡슐 유도, 얼룩, 및 인도 잉크를 사용 하 여 이미지 수집 워크플로 …

Discussion

수십 년 동안, 캡슐 mycologists와 임상 C. neoformans cryptococcosis 병원 체에 대 한 주요 독성 요인으로 그것의 역할 때문에 관심된에 대 한 연구의 주요 초점 되었습니다. 에 현미경 검사 법을 사용 하 여 긴장 캡슐 크기 차이 측정 하 고 다른 성장 아래 조건 병원 체 및 다양 한 자극 (, 서로 다른 환경 조건에 그것의 응답에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 잠재적인 약물 치료,

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 감사 생물학과 분자 생물 과학 (MOBI) 박사 중간 테네시 주립 대학 (MTSU)에이 연구에 대 한 자금 제공. 프로젝트 또한 MTSU 재단에 의해 D.E.N.에 게 수 여 특별 한 프로젝트 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다.

Materials

Capsule Induction
C. neoformans cells The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).  The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). 
Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) Fisher Scientific DF0428-17-5
Phosphate Buffered Saline (PBS) This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)
DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate GE Life Sciences SH30022.01
6-well plates Falcon CL5335-5EA
Shaking incubator Thermo Scientific  MaxQ6000
CO2 incubator Fisher Scientific Isotemp
Centrifuge Thermo Scientific Legend XTR
Staining
Microcentrifuge Thermo Scientific Legend Micro 21R
India ink Fisher Scientific 14-910-56
Calcofluor white Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) 
PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
Superfrost microscope slides Fisher Scientific 12-550-143
Glass coverslips Corning 2855-18 #1.5 thickness
Clear nail polish or other non-toxic sealant
Image Acquisition 
Immersion oil Cargille  16484
Light microscope with immersion oil objective Zeiss Zeiss Axio A1 with a Plan – NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective
Light microscope camera Zeiss Zeiss Axiocam ErCD camera
Confocal microscope with oil immersion objective Zeiss LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. 
Confocal microscope software Zen 2009
Confocal microscope camera Nikon Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. 
Widefield imaging software Nikon Elements (Nikon)
Capsule Measurement
Image editing software Photoshop (Adobe)
Microscope software for manual measurement Axiovision (Carl Zeiss)
Image analysis software for automated meesurement Aivia (DRVision Technologies)
Spreadsheet software Excel (Microsoft)

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Citer Cet Article
Guess, T., Lai, H., Smith, S. E., Sircy, L., Cunningham, K., Nelson, D. E., McClelland, E. E. Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (132), e57171, doi:10.3791/57171 (2018).

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