Adipogenic 차별 평가의 전통적인 방법은 저렴 하 고 사용 하기 쉬운, 하지만 특정 유전자 발현에서 변화 하지 않습니다. 성숙한 adipocytes 계보 특정 마커를 사용 하 여에 중간 엽 세포 분화 척도를 분석 결과 개발 했습니다. 이 분석 결과 기초 연구 및 임상 의학에 걸쳐 다양 한 응용 프로그램 있다.
여러 가지 염료 검출 하는 adipocytes에 중간 엽 세포의 분화에서 사용 하기 위해 현재 사용할 수 있습니다. 염료, 기름 빨간 O, 등 있으며 저렴 한, 사용 하기 쉽고 널리 사용 중간 엽 세포의 adipogenic 잠재력을 분석 하는 실험실에 의해. 그러나, 그들은 유전자 녹음 방송에 있는 변화에 특정 되지 않습니다. 들어오면 중간 엽 세포는 그것의 운명 adipogenic 계보를 분석 하는 유전자 특정 차별화 분석 결과 개발 했습니다. 지방산 바인딩 단백질-4 (FABP4), adipogenic 차별화의 계보 특정 표식에 대 한 면역 라벨 시각화 및 차별화 된 셀의 정량화를 사용할 수 있습니다. Adipogenic 96 잘 microplate 형태로 중간 엽 세포의 감 별 법 잠재력을 계량 수 응용 프로그램의 수에 대 한 유망한 의미를 갖는다. 성인 중간 엽 기질 세포의 사용을 포함 하는 임상 시험의 수백 그리고 현재 시간과 같은 임상 시험의 사이 특히 치료 결과 연관 어렵다. 이 간단한 높은 처리량 FABP4 분석 결과 환자 파생 된 세포의 분화 가능성을 평가 대 한 양적 분석 결과 제공 하 고 다른 격리 및 확장 메서드를 비교 하기 위한 강력한 도구입니다. 이것은 특히 중요 한 엽 셀 제품에 환자에 게 투여 되 고 세포의이 성분의 증가 인식 주어진입니다. 분석 결과 또한 비만 사전 당뇨병 연구에서 특히 높은 처리량 마약 검사에서 잠재적인 유틸리티가 있다.
세포 치료 (ISCT) 정의 multipotent mesenchymal stromal 세포를 국제 사회에 의해 설립 하는 주요 요구 사항 중 하나는 셀 adipogenic, osteogenic chondrogenic 혈통으로 차별 하는 능력 있어야 1. 화학 염료1를 사용 하 여 고분자 제품의 검색에 의존 하는이 3 개의 계보에 차별화를 측정의 전통적인 방법. (어떤 지질을 받은 세포에 있는 뚱뚱한 작은 물방울 얼룩) 기름 빨간 O 같은 염료는 저렴 하 고 사용 하기 쉬운; 그러나 그들은 각 각각 리니지2로 중간 엽 세포 분화 때 발생 하는 유전자 발현에서 특정 변경 내용을 검색 하지. 여기, 우리는 지방산 바인딩 단백질-4 (FABP4)3,,45adipogenic 계보 관련 마커 단백질 식을 단정 차별화 분석 결과 개발 했습니다. FABP4 murine 3T3-L1 adipocytes3 에서 처음 발견 하 고 인간의 피하 지방 조직6에 표현 될 나중에 발견 되었다. 그것은 세포에 의해 지방산 통풍 관을 안내 하는 보호자 역할을 하며 lipolysis4과정 참여 cytosolic 단백질.
전조 세포 감 별 법 분석 실험에 사용 했다 지방이 많은 파생된 mesenchymal stromal 세포 (ASCs)7,8. ASCs 골 수 유래 중간 엽 줄기 세포 (MSCs BM), 성인8,9주요 중간 엽 줄기 세포 인구와 많은 속성을 공유. ASCs 제공 임상 응용 프로그램에 여러 이점이 BM MSCs 셀의 큰 수확량 더 쉽게 액세스할 수 조직 소스8,9에서 고립 될 수 있다. 고립 된 세포 인구 ASCs로 정의할 수 특정 기준을 충족 해야 합니다. 첫째, 그들은 표준 문화 조건1플라스틱 조직 문화 배 준수를 제시 해야 합니다. 그들은 또한 특정 표면 항 원 식1을 제시 해야 합니다. 뱀과 ASCs 긍정적인 표면 항 원 표현 CD34, CD73, CD90, 낮은 표현의 CD105, CD45 그리고 HLA-DR10의 부정적인 표현 특징입니다. ASCs (점착 정화 ASCs) 28 일에 대 한 플라스틱에 경작에 의해 순화 CD73 CD90, CD105 긍정적인 표현과 CD34, CD45 그리고 HLA-DR10의 부정적인 표현을 표시 합니다. 마지막으로, 세포는 다양 한 계보1,,78로 분화 하는 능력을 유지 해야 합니다.
그래서 우리는 FABP4, 세포 내에서 단백질을 시각화 하기 위해 immunochemistry를 사용 하 고 다음 단일 셀 수준에 FABP4 식 계량 Adipogenic 차별화 프로토콜 다른 체형 혈통 유전자 사이 FABP4 식의 눈에 띄는 upregulation 유도 자동화 된 형광이 콘텐츠 심사 현미경을 사용 하 여. 이 메서드는 전통적인 염료에 유리한 체형 혈통 차별화의 매우 구체적인 확인 하면. 이러한 유전자 특정 계보 분석 심사 방법 또한 높은 콘텐츠와 결합 사용 특정 계보를 차별화 수 있는 다른 유형의 세포 준비 내의 셀의 비율의 정량화. 우리의 연구에서 우리는 세포 배양 후 갓 격리 ASCs의 adipogenic 감 별 법 잠재력의 손실을 확인 하 FABP4 분석 결과 사용.
이 문서는 유틸리티와 정확 하 게 감지 하 고 계량 성숙한 adipocytes mesenchymal stromal 세포에서 파생 된 FABP4 immunolabelling의 장점을 보여 줍니다. FABP4 염료 고분자는 레이블이 변경13,14 사용 하는 계보 특정 단백질3,4,5 다른 일반적으로 반대로 성숙 adipocytes의 표현에 변화를 감지할 수 있다 기름 빨간 O15, 나 일 레드16 , 수단 블랙17등. FABP4 immunolabelling의 세포질 형태학 변화 분석과 시각화 수 있습니다. 이것은 양이 많은 반전 녹음 방송 모든 시각화5,18,19 없이 대 본 수준에서 변경 내용을 분석 하는 PCR (RT-정량)를 사용 하 여 앞에서 설명한 방법에 독특한 이점을 ,20또는 정지20일 또는 하 더럽혀 서 세포를 필요로 하는 cytometry 필요 단백질19,20을 lysed 세포. FABP4 immunolabelling 안정 된 고정 셀에서, 솔루션에서 밖으로 누출 되지 않습니다 이며 쉽게 시각화에 대 한 허용 하 고 자동화 된 분석에서 정확도 추가 핵 겹칠 것입니다 cytosolic 단백질 때 세포의 부착 단층에서 분류 되 고.
이 콘텐츠 심사 빨리, 정확 하 고, 재현 고 객관적 이기 때문에 유리 하다. 이미지 수집 및 분석 최소한의 수동 조작이 필요로 악기의 자동 처리에 의존 하 고 이후 그것은 시 약 및 연구원 시간, 비용 효율적인 사용을 위한 한 플랫폼을 제공 합니다. 이 콘텐츠 심사의 재현성 분석 실험31와 여러 가지 요인 정확성에 중요 한 발견 했다. 항 원 식의 정량화는 이미지 품질에 의존합니다. 성공적인 이미지 분석에 대 한 이미지 잘 당 각 채널에서 고 해야 합니다 초점에 회색 값에 대 한 최적의 동적 범위 내에서을 (자동 노출 설정을 이상적입니다). 초점 또는 잘못 된 결과를 포화 이미지 리드 아웃.
이 문서에서 설명 하는 방법의 몇 가지 잠재적인 한계는 다음과 같다. 전문된 이미징 장비 및 분석 소프트웨어에 대 한 요구 사항. 이 문서의 범위 밖에 다른 오픈 소스 소프트웨어 옵션 (예: ImageJ32,33, 피지34, CellProfiler32,35) 비슷한 이미지 세분화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. 작업; 그러나 그들은 다운로드 하 고 온라인 사용할 수 매크로 맞게 하거나 매크로/명령 그들의 특정 분석 파이프라인에 대 한 작성 능력 필요지 않습니다. 모든 자동된 이미징 분석 파이프라인에 배경 잡음의 수준이 이다. 이 크게 파편, 표시 될 수 있습니다 주의 샘플 준비와 이미징 및 분석 플랫폼의 주의 설정에 대 한 필요성을 강조 하 고 불 쌍 한 이미지 품질 또는 분석 오류. 쥐에 FABP4 레이블 undifferentiated 창시자30; 감지 발견 되었습니다. (어떤 미 분화 세포의 구성) 본이 연구에서는 컨트롤 특정 FABP4 얼룩이 없는 동안. 이 아래 점수 FABP4 식 검사의 필요성 undifferentiated 분석 결과 고용은 각 생물 학적 맥락에서 창시자.
순서는 FABP4 라벨 및 얼룩, 기름 빨간 O 생물학으로 관련 될 필요가 이미지 분석에서 출력 측정 사이의 비교를 그립니다. 따라서, 측정, ‘% 긍정적인 세포’ FABP4를 위해 사용 되었다 그리고 ‘셀 당 얼룩의 영역’ 기름 빨간 o.를 위해 사용 되었다 그것은 측정 ‘% 긍정적인 세포’ 기름 빨간 o 이라는 지방 방울을 정확 하 게 주어진된 핵; 특성 수 없었기 때문에 우리의 연구에 셀을 표시 사용 되지 않았습니다. 지방 방울 셀 몸 전체 크기, 수 및 배포에서 상당히 다양 하 고 거의 핵과 겹쳐. 기름 빨간 O 가변성 얼룩 다른 조직 소스;에서 파생 된 세포 사이 존재 반면 긍정적인 세포 법안은 현재 연구에 대 한 적절 한 %, 또 다른 그룹 사용 하고있다 성공적으로 adipocytes 인간의 동맥 줄기 세포22 에서 파생 된 척도를 스팬을 하나의 큰 뚱뚱한 작은 물방울으로 나타나 기름 빨간 O 얼룩은 세포질 및 핵 및 활성화 데이터 % 긍정적인 세포로 제시를 겹쳐.
대조적으로, FABP4 immunolabelling의 형태학은 다른 조직 소스23,,2425의 범위에서 파생 하는 adipocytes에 일치. 차별화의 문화 내의 셀의 비율을 정할 수는 응용 프로그램의 수 있습니다. 성인 중간 엽 기질 세포 치료 사용의 다양 한 범위에 대 한 중요 한 약속을 잡으십시오. 임상 번역 생겨났다는 중요 한 문제는 환자26사이, 절연27,28, 사이트 간에 그리고 격리12 방법 사이의 이러한 세포의 기능에 내재 된 변동성 및 치료 용 세포 숫자12 의 확장. 그것은 표시 되었습니다 이전 부착 stromal 세포의 문화는 자주 다른 유형의 일부 세포 분화 및 일부 12,17 우리의 FABP4로 분석 결과 ASC 문화에 대 한 방법을 보여 줍니다. 이 같은 분석 실험, 농축 기술로 결합, 이질적인 문화 계보 관련 차별화의 능력 안에서 하위 인구를 식별 하는 데 도움이 됩니다. 데이 FABP4 분석 결과 등 표준화, 정량 분석 결과 모든 변수, 그리고 시간과 사이 임상 치료 결과 평가 하는 잠재력 사이 비교에 대 한 간단한 방법을 제공 한다.
반자동 방식에서 FABP4의 정량화는 많은 경우에 기증자 및 샘플 객관성과 재현성 분석에서을 수 있습니다. 또한 라벨은 세포질, 그것은 잠재적으로 수 비만 연구에 상당한 중요성의 구별 증식 (증가 체형), 비 (체형 크기의 확대) 분석을 사용할 어디 비 뚱뚱한 개인21에 많은 장애에 강력 하 게 연관 됩니다. 비만 약물 제어 지질 저장의 식별에 대 한 관심의 상당한을 했다 있다. 이 FABP4 분석 결과 또한 지질 축적을 억제 하기 위해 그들의 능력에 대 한 화합물의 수천을 심사에 대 한 간단한 판독을 제공 한다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 지방 조직 및 수집 하 고 연구 사용에 대 한 우리에 게이 리소스를 제공 하는 연구 전문가의 기증자에 게 감사. 우리는 자금 지원을 러간에 의해 인정 하 고 싶습니다. 우리는 또한 videoing 및이 문서의 제출에 대 한 편집 비용 자금에 대 한 오클랜드 대학, 학부의 의료 및 건강 과학 성능 기반 연구 기금 감사.
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |