解離性個体の親和性の浄化 (BiCAP) によって多蛋白質シグナリング複合体
Summary
本稿では、二分子の相補性の親和性の浄化 (BiCAP) のプロトコルについて説明します。この手法は競合結合パートナーで形成された複合体と同様、国連複合体の個々 のタンパク質を除く、特定の分離と任意の 2 つの相互作用の蛋白質の下流のプロテオーム解析を促進します。
Abstract
蛋白質の複合体のアセンブリは多くの細胞シグナル伝達経路の調節中枢機構です。生物医学研究の主要な焦点は、どのようにこれらの動的蛋白質の複合体は特定の生物学的応答を送信するために複数のソースからの信号を統合する行動し、どのように多くの病気設定この自由化になる解読です。この重要な生化学的メカニズムの重要性にもかかわらずこれらの多分子シグナリング複合体の特定および敏感なデコンボリューションを容易にすることができます実験技術の欠如があります。
ここでこの欠点については、特定の構造生物学: ナノボディで、我々 が分子の相補性の親和性の浄化 (BiCAP) と呼ばれる、タンパク質の否定回路試金の組み合わせにより対処します。この手法は、特定の分離と国連複合体の個々 の蛋白質と競合結合パートナーで形成された複合体の排除の相互作用の蛋白質のペアの下流のプロテオーム解析を促進します。
BiCAP 手法は下流の実験的アッセイの広い配列に適応でき、この手法によって与えられる特異性の高いより微妙な捜査蛋白質複雑なアセンブリの力学、現在よりもを使用して標準的な親和性の浄化技術。
Introduction
蛋白質複雑なアセンブリは多くのシグナル伝達経路の1,2の時空間特異性を維持するために重要なプロセスです。この規制の役割の重要性が広く認識され、これらの複合体を精査する使用できる実験手法の欠如があります。Interactomics 研究のほとんどは個々 のタンパク質や各複雑なコンポーネントの連続濃縮との相互作用に焦点を当てます。ここで競争パートナー3を連結して形成される複合体と同様、タンパク質の個々 の部分を除く、特定の蛋白質の二量体の分離手法を提案します。我々 はこの手法を求めている分子の相補性の親和性の浄化 (BiCAP) それとしての小説を使って既存タンパク質フラグメント相補性アッセイは二分子の蛍光補完 (BiFC) の組み合わせである、GFP とその誘導体に向かって生物学: ナノボディでコンホメーション特異の組換え (を参照してください材料テーブル).
典型的なタンパク質フラグメント否定回路試金はルシフェラーゼ4β-ガラクトシダーゼ5、緑色蛍光タンパク質 (GFP)6 (などの記者のフラグメントに分割する溶ける「餌」と「獲物」蛋白質の表現に依存しています。図 1 a)。餌や餌の蛋白質の相互作用によって分割記者ドメインお勧め餌の対話ができるよう、機能的な構造にフォールディングを可視化したり定量化タンパク質を捕食します。BiCAP 作られたこの技術のバージョンから適応された GFP バリアント金星のフラグメントの使用します。蛍光蛋白質否定回路試金は生細胞でのタンパク質間相互作用を可視化するため人気のある方法ですが、今までこの関数を 1 つの7に限られています。BiCAP としてこの手法だけでなく、可視化が、また分離と尋問結果の蛋白質蛋白質の相互作用の点で重要な進歩を表します。
図 1: BiCAP 手法の背後にある構造のプリンシパル。(A) 分子蛍光補完表示の背後にあるプリンシパルをアウトライン図 N ターミナル V1 または V2 の C 末端タグ付き ‘餌’ と ‘捕食’ 蛋白質フルレングスの金星タンパク質の断片。(B) GFP 生物学: ナノボディで (緑) と (グレー) V1 と V2 (オレンジ) フラグメント (PDB 加盟 3OGO) の位置を示すられた金星の間 (シアン) 相互作用界面の構造解析。この図は再発行 fromCroucher ら3転載 AAAS から権限を持つです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
フュージョン パートナー間の相互作用で発生しない限り親和性の低さに関連付ける (V1 と V2 の名前) 金星の 2 つの非蛍光性フラグメントの手法により BiCAP を使用します。このインスタンスで、2 つの分割ドメインは fluorophore (図 1 b)6の機能 β バレル構造にフォールディングします。BiCAP の重要な技術革新は、組換え GFP 生物学: ナノボディで、正しくられたと折り畳まれた蛍光体 (にある β バレル GFP (と金星などの亜種) の三次元のエピトープを認識するの導入から来る図 1 b)8。重大に、GFP の生物学: ナノボディでは個々 の金星フラグメントのいずれかにバインドされません。これは蛋白質二量体の分離を促進する後にのみ 2 つのタンパク質は、化学物質による、強制相互作用9を使用するメソッドから取得したものより代表的な結果につながる、彼ら自身の意志の複合体を形成しています。
BiCAP は特にこれらの複合体のシグナル伝達における役割の理解の粒度を改善するために下流のアプリケーション数併用できる可能性のある複数のタンパク質を中心に強力な手法.また、蛋白質の相互作用の場の可視化を許可する重要な機能が含まれます。まで BiCAP の受容体チロシン キナーゼ (RTK) ダイマー3のインタラクトームを解析の効果的な方法として実証されていますが、この方法の適応性を意味するそれはほぼすべてのタンパク質相互作用のコンテキストで採用されることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
BiCAP は、個別のコンポーネントおよび彼らの競合結合パートナー3を排除しながら特定の蛋白質の二量体を隔離するための強力な方法です。BiCAP は BiFC6と呼ばれる蛍光蛋白質否定回路試金の適応に基づいています。BiFC と近接の結紮アッセイを含む既存の方法7生きているセルの蛋白質の相互作用を定量化を視覚化して広く使用されているが…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.R.C がん研究所のニューサウス ウェールズ州の研究員であり D.N.S 癌研究所のニューサウス ウェールズ州の研究員であった。がん研究所 NSW (13/FRL/1-02 ・ 09/CDF/2-39)、NHMRC (プロジェクト助成金 GNT1052963)、アイルランド科学財団 (11/SIRG/B2157)、ニューサウス ウェールズ州のオフィスの科学と医学研究、客家によって資金が供給された研究成果を本稿では発表親睦とモスティン家族財団。J.F.H. と r. s. オーストラリアの大学院賞受賞者であった。
Materials
| LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12538120 | Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Thermo Fisher Scientific | EO0491 | |
| 14 mL round-bottomed polypropylene tube | Corning | 352059 | |
| Ampicillin | Roche Diagnostics Australia | 10835242001 | Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water. |
| Miniprep kit | Promega Corporation | A1330 | |
| Maxiprep kit | Life Technologies Australia | K2100-07 | |
| DMEM | Gibco | 11995-073 | |
| FBS | Life Technologies Australia | 10099-141 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies Australia | 15070-063 | |
| jetPRIME transfection buffer | Polyplus | 114-15 | |
| jetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-15 | |
| PhosSTOP (Phosphatase inhibitor) | Sigma-Aldrich | 4906837001 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.1832 | |
| GFP-Trap_A | Chromotek Gmbh | gta-100 | GFP nanobody coupled to agarose beads |
| N-terminal GFP monoclonal antibody | Covance | MMS-118P | Will detect the V1 tag within the BiFC vectors |
| C-terminal GFP monoclonal antibody | Roche | 11814460001 | Will detect the V2 tag within the BiFC vectors |
| Sample buffer | Invitrogen | NP0008 | Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol. |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega Corporation | V5117h | |
| LoBind microcentrifuge tubes | Point of Care Diagnostics | 0030 108 116 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149-5G | Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water |
| Trifluoroacetic Acid – Sequanal Grade | Thermo Fisher | 10628494 | |
| 3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) – 4.7 cm | Thermo Fisher | 14-386-2 | To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below. |
| C18 Stage Tips, 10 µL bed | Thermo Fisher | 87782 | |
| Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL | Thermo Fisher | FSBA117-50 | |
| 1.9 μm C18 ReproSil particles | Dr. Maisch GmbH | r119.aq. | Stationary phase particles |
| Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade | Thermo Fisher | FSBA955-4 | |
| Easy-nLC HPLC | Thermo Fisher | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Fisher | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Non-ionic detergent (100%) |
| DH5α cells | Thermo Fisher | Heat-shock-competent cells |
References
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