角膜移植片の間質特徴の組織学的様解析のための全視野光コヒーレンス顕微鏡

ここに記載されているすべての方法は、ヘルシンキ宣言の信条に従って実行され、人間の組織に関する国際的な倫理要件に従いました。これは前向き観察症例対照研究でした。患者からインフォームドコンセントを得た。フランスの治療基準やフォローアップの変更は行われなかった。治験審査委員会(IRB)の承認は、イル・ド・フランスV(14944)の患者保護委員会から得られました。 1.組織の選択と準備 ドナー角膜を選択します。 臓器培養培地26に保存されたドナー角膜をデキストラン補充臓器培養培地に3日間移し、FF−OCMイメージング28の前にデタージェッセンス27を可能にする(材料の表を参照)。 サンプルを準備します。 保存媒体に浸した角膜を、上皮を上に向けてサンプルホルダーに配置します。 角膜の上に清潔なシリカカバーガラス(サンプルホルダーに付属)を置き、サンプルがカバーガラスの下にわずかに平らになり固定され、比較的均一なイメージング面が得られるまで、ベースをゆっくりと回してホルダーを閉じます。気泡を避けるために予防策を講じてください。 液浸媒体としてカバーガラスに眼科用または光学用ゲルの厚い層を適用します。 2. FF-OCMの初期化、セットアップ、画像取得 デバイスを初期化します。 デバイスの背面にある電源スイッチを操作して、デバイスの電源を入れます。デバイスの前面にある緑色のLEDの点灯は、電源がオンになっていることを示します。 前面の電源スイッチを操作して、専用コンピュータとハロゲン光源の電源を入れます。 デスクトップショートカットをダブルクリックして、取得ソフトウェア( 材料表を参照)を起動します。 可動トレイを除いて、イメージングステージが透明であることを確認してください。次に、「OK」をクリックして、プロンプトでモーターを初期化します。 トレイを引き出し、専用容器にサンプルホルダーを挿入し、トレイをそっと押し戻します。 デバイスをセットアップします。 指定された必須フィールドに「サンプル識別子」を入力します。必要に応じて、「サンプルの説明」および/または「試験の説明」を入力します。 準備ができたら[マクロ画像の取得]をクリックして、後で横方向の配置とナビゲーションの目的で使用できるサンプルのスナップショットを作成します。満足したら、プロンプトで「はい」をクリックして画像を検証し、その後、デバイスはサンプルトレイを対物レンズの下に移動し、自動調整を実行します。 先に進む前に、顕微鏡の対物レンズが光学ゲルに十分に浸されていることを確認してください。 スタックを取得します。 「探索」タブを選択して、取得を準備します。 画像のスタックを取得する前に、ジョイスティックの移動または画面上の手動選択を介して(つまり、取得したマクロ画像の赤い四角をクリックして目的の場所にドラッグすることにより)、角膜の中央に移動します。 ジョイスティックの回転、スライダーの調整、またはグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)での手動キーボード入力を使用してイメージング深度を変化させ、平均値を調整します(最適な角膜イメージングには、通常、平均40が推奨されます)。注:これは、角膜サンプルの厚さと、角膜の厚さ全体を通して画像化するために必要な平均化を決定するために行われ、最初と最後の画像の位置を深さで記録します。カバーガラスの底面は、断層画像(GUIの右側)に見られる平行な干渉縞を作成し、角膜表面の位置決めを容易にします。 角膜表面値または最初の画像位置の深さを「深さ」フィールドに入力します。 「取得タブ」を選択して、画像を取得します。 「スライス間隔」(デフォルトの推奨設定は1μmで、デバイスの軸方向の分解能に一致)を選択し、「スライス数」の下に角膜の厚さの値を入力します。 パラメータと取得時間を確認し、問題がなければ「OK」を押して取得を開始します。 取得中は、FF-OCMが配置されているテーブルとの接触を避けてください。 3. 取得画像の管理 画像を表示およびエクスポートします。 デスクトップショートカットをダブルクリックして、FF-OCM表示ソフトウェア( 材料表を参照)を起動します。取得した画像(サンプルIDで識別)は、「地域研究」リストに表示されます。 マクロ画像と取得した画像スタックの両方を含む対応するサンプルIDを持つスタディを選択し、一連の画像を右クリックして「DICOM」形式を選択して、生のピクセルデータとメタデータを保持し、さらに分析することで後者を「エクスポート」します。 一連の画像をダブルクリックして、多面再構成(MPR)モードを使用して、3D画像スタックを 面 図と断面図で表示します。画像をナビゲートし(マウスホイールのスクロールやスライダーの調整など)、各スタックの代表的な 顔 と断面図を選択します。 ウィンドウの右下にあるアイコンをクリックして、「DICOM」形式を使用して、選択したビューをエクスポートします。 画像をインポートします。 デスクトップショートカットをダブルクリックして画像処理ソフトウェア( 材料表を参照)を開き、「プラグイン」の下の「バイオフォーマット」「インポーター」に移動してDICOM画像をインポートします。「Bio-Formatsインポートオプション」ウィンドウで「類似した名前のファイルをグループ化する」が選択されていることを確認してください。 4. 画像解析:間質形態・特徴の定性的・定量的評価 間質層とボーマン層の厚さを評価します。 角膜断面、たとえば断面25を横切る5つの等間隔のポイントで距離を手動で測定します。既知の距離の2点の間に線を引き(画像全体の左から右、つまりデフォルトの視野である1,024ピクセルまたは780μmに従うなど)、[分析]に移動して[スケールの設定]を選択し、適切なフィールドに[既知の距離]と[長さの単位]を入力して、[OK]をクリックします。 距離が不明な2点の間に線を引きます。ステータスバーから直接測定された長さまたは距離を読み取ります。 平均と変動係数(COV)を記録します。ボーマンの層の厚さが6.5μm未満で、COVが18.6%を超える場合は、異常な角膜間質と関連しています25。 角化細胞密度を決定します。 共焦点顕微鏡の慣例に従う:7つのグループで間質 と顔 の画像を合計して、同等の厚さのスライスを生成します。このためには、「画像」タブに移動し、「スタック」の下の「再スライスZ」を選択します。 間質24,25を通る進行における異なる(減少する)細胞密度を考慮に入れる。このため、間質は深さに応じて4つの領域で構成されていると考えることができます:(1)ボーマン層の下の非常に前部間質、つまり間質全体の厚さの2%です。残りの間質(すなわち、間質全体の厚さの98%)は、同じ厚さの3つのゾーンを有する:(2)前間質、(3)中間質、および(4)後間質。 さらなる分析のために、非常に前間質のための利用可能なすべての enface スライス、前間質のための15の画像、中間質の5つの画像、および後部間質の5つの画像を含める(ここで、信頼できるカウントに必要な領域あたりの画像数は段階的分析によって決定された29)。 各 エンフェイス 画像で、300 μm x 300 μmの関心領域を選択します。核の視覚化を強化するには、[編集]タブの[反転]を使用して画像を反転し、コントラストと明るさを調整します。後者の場合は、「画像」に移動し、「分析」の下の「明るさ/コントラスト」に移動します。 細胞核を手動で計数することは、例えば「細胞カウンタ」機能25を使用する。このためには、「プラグイン」に移動し、「分析」の下の「セルカウンター」に移動します。「初期化」を押してから、カウンタータイプを選択します。次に、反転画像内の暗い楕円形の特徴をクリックして細胞核のカウントを開始し、画像25の4つの側面のうちの2つだけについて画像の境界に着地するものを考慮する。 角化細胞密度が健康な被験者よりも患者(円錐角膜など)で低く、疾患の重症度と相関することが示されている共焦点顕微鏡法に従って、細胞密度を面積密度、つまり細胞/mm²(カウントした細胞の数を0.09で割って細胞/90,000μm²から細胞/mm²に変換する)で記録します。注:移植後に完全に透明な角膜移植片を得るために、角質細胞密度の最小閾値が必要かどうかを判断するには、さらなる臨床研究が必要です。 間質反射率を評価します。 例えば「Z軸プロファイル」機能および/またはカスタムソフトウェア25,30,31を使用して、間質画像スタックの平均強度深度プロファイルを生成する。注:FF-OCMは、サンプルの強度ではなく後方散乱された光の振幅を測定するため、これらは実際には振幅深度プロファイルです。各 面 スタックの平均グレーレベルを計算します。 最小グレー値を減算し、最大グレー値で正規化します。 間質の深さ(間質の厚さの%)の関数として対数スケールで表示します。 結果の対数プロファイルを線形回帰直線で近似し、二乗残差の合計(最小二乗適合)を最小にします。 線形性の尺度としてR2乗値(R²)を記録します。0.94未満の値は、角膜の病理を示している可能性があります25。注:病理学の存在による線形対数回帰モデル(または単指数減衰モデル)の不十分さを単なる測定ノイズと区別するために、ベイズ推定による信号分析が行われてもよい31。また、線形対数(または単指数)間質深さプロファイル(例えば、R二乗値30または1に近いビルジ比31で表される)を有する角膜において、信号減衰速度からの光子平均自由行程の計算は、透明性の程度31をさらに定量化するために使用され得る。 他の間質の特徴と病気の指標の可視性を評価します。 瘢痕、線維組織、湖、またはフォークト脈理の存在を確認します。 間質内の神経の平均厚さを評価します(測定に十分に見える場合)24。間質神経が最も目立つ 顔の画像を 1つ選択します(通常は間質中部領域)。 たとえば5点24で神経の厚さを測定し、平均と標準偏差を計算します。9μmを超える神経の厚さは、円錐角膜24などの病理学の追加の指標となる可能性があります。