5-Bromouridine ्र और Immunoprecipitation का उपयोग कर आरएनए संश्लेषण की जांच
Summary
इस विधि से आरएनए संश्लेषण का उपाय किया जा सकता है । 5-Bromouridine कोशिकाओं को जोड़ा और संश्लेषित आरएनए में शामिल किया गया है । आरएनए संश्लेषण तुरंत लेबलिंग के बाद आरएनए निष्कर्षण द्वारा मापा जाता है, उल्टे प्रतिलेखन और मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा लेबलित आरएनए और विश्लेषण के 5-Bromouridine-लक्षित immunoprecipitation द्वारा पीछा किया.
Abstract
जब स्थिर राज्य आरएनए स्तर दो शर्तों के बीच तुलना कर रहे हैं, यह अंतर है कि परिवर्तन उत्पादन या आरएनए के क्षरण में बदलाव के कारण होते हैं कि भेद करने के लिए संभव नहीं है. यह प्रोटोकॉल आरएनए उत्पादन की माप के लिए एक विधि का वर्णन करता है, immunoprecipitation द्वारा पीछा आरएनए के 5-Bromouridine लेबलिंग का उपयोग कर, जो एक छोटी समय सीमा के भीतर संश्लेषित आरएनए की जांच में सक्षम बनाता है (उदा., 1 ज) । α-amanitin और actinomycin डी जैसे विषैले transcriptional अवरोधकों के उपयोग पर 5-Bromouridine-लेबलिंग और immunoprecipitation का लाभ यह है कि अल्प अवधि के उपयोग के दौरान कोशिका व्यवहार्यता पर कोई या बहुत कम प्रभाव नहीं होते हैं । हालांकि, क्योंकि 5-Bromouridine-immunoprecipitation केवल लघु लेबलिंग समय के भीतर उत्पादित आरएनए कब्जा, धीरे के रूप में अच्छी तरह से उत्पादित के रूप में तेजी से नीचा आरएनए इस विधि द्वारा मापने के लिए मुश्किल हो सकता है. 5-Bromouridine-बला आरएनए 5 द्वारा कब्जा-Bromouridine-immunoprecipitation रिवर्स प्रतिलेखन, मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया, और अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । आरएनए के सभी प्रकार की जांच की जा सकती है, और विधि इस उदाहरण में प्रस्तुत किया जाता है के रूप में mRNA को मापने के लिए सीमित नहीं है ।
Introduction
5-Bromouridine (बरू) immunoprecipitation (आईपी) संक्षिप्त लेबलिंग अवधि1,2के दौरान सेल फिजियोलॉजी पर कोई या बहुत सीमित प्रभाव के साथ कोशिकाओं में आरएनए उत्पादन के अध्ययन की अनुमति देता है । विधि एंटी-बरू एंटीबॉडी (चित्रा 1) का उपयोग कर बला शाही आरएनए के आईपी द्वारा पीछा किया सिंथेटिक uridine व्युत्पंन बरू में नव संश्लेषित आरएनए के निगमन पर आधारित है.
यह दशकों के लिए जाना जाता है कि प्रोटीन संश्लेषण transcriptionally विनियमित किया जा सकता है, और प्रतिलेखन कारकों के अस्तित्व से अधिक ५० साल पहले की परिकल्पना की गई थी3. आज, यह ज्ञात है कि कई बीमारियों प्रतिलेखन और आरएनए स्थिरता के dysregulation की वजह से कर रहे हैं (पूरक आंकड़ा एस 4 संदर्भ में1, 2), और आरएनए उत्पादन में परिवर्तन को मापने की क्षमता रोग को समझने में बहुत महत्व का है विकास.
दूसरी ओर, आरएनए उत्पादन को विनियमित करने के लिए उपकरण बहुत कम या बहुत ज्यादा प्रोटीन अभिव्यक्ति, या पार्किंसंस रोग (पीडी) में जैसे प्रोटीन संचय की वजह से रोगों के इलाज के लिए नई संभावनाएं प्रदान करते हैं । प्रमुख प्रोटीन पीडी में अघुलनशील समुच्चय के रूप में जमते α-synuclein है, और α-synuclein के स्तर सीधे रोग से जुड़ा हुआ है, के रूप में α-synuclein जीन के जीन गुणा पारिवारिक पीडी5का कारण बनता है । इसके अलावा, एक एकाग्रता निर्भर तरीके से α-synuclein समुच्चय । Downregulation α-synuclein mRNA स्तरों इसलिए एक दिलचस्प चिकित्सीय रणनीति है, जो सफलतापूर्वक आरएनए हस्तक्षेप का उपयोग करने के लिए पीडी मूषक में न्यूरॉन सेल नुकसान को कम करने के लिए प्राप्त किया गया है6,7.
यह या तो रोग या उपचारात्मक हस्तक्षेप की वजह से आरएनए उत्पादन में परिवर्तन को मापने के लिए सक्षम होना करने के लिए महत्वपूर्ण है । ऐसे रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (RT-qPCR) के द्वारा पीछा के रूप में, आरएनए के स्थिर राज्य स्तर को मापने के लिए कला विधियों के राज्य, transcriptional विनियमन के कारण परिवर्तन के बीच भेद करने में सक्षम नहीं हैं या बदल द्वारा आरएनए स्थिरता । आरएनए क्षय दरों की जांच के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि क्षय RNAs की माप के बाद α-amanitin या actinomycin डी के रूप में यौगिकों का उपयोग transcriptional मशीनरी के अवरुद्ध है. हालांकि, कुछ कोशिकाओं में प्रतिलेखन की एक समग्र रुकावट के साथ जुड़े समस्याओं, ऐसे apoptosis8,9की प्रेरण के रूप में कर रहे हैं । साइटोटोक्सिक प्रभाव के बगल में, transcriptional अवरोधकों को भी इस तरह के धीमी गति सेलुलर α-amanitin और actinomycin डी की विशिष्टता की कमी के रूप में कई तकनीकी मुद्दों, वर्तमान (संदर्भ में की समीक्षा की10) ।
प्रतिलेखन की समग्र रुकावट से बचने के लिए, न्यूक्लियोटाइड एनालॉग उपयोग किया गया है, जैसे 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU), और बरू. ये आसानी से स्तनधारी कोशिकाओं द्वारा लिया और नव संश्लेषित आरएनए में शामिल कर रहे हैं, एक विशिष्ट समय-सीमा के भीतर आरएनए के पल्स लेबलिंग को सक्षम करने. बरू 5-यूरोपीय संघ और 4-टू से भी कम विषाक्त है, यह पसंद की पसंदीदा एनालॉग11,12बना रही है ।
बरू-आईपी आरएनए संश्लेषण और स्थिरता की दर दोनों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इस तरह कुल आरएनए में परिवर्तन के अंतर्निहित कारणों के बीच भेद । इस अनुच्छेद आरएनए संश्लेषण की माप पर ध्यान दिया जाएगा और आरएनए स्थिरता की जांच पर विवरण के लिए2 संदर्भ को संदर्भित करता है । शाही सेना के संश्लेषण की जांच करने के लिए, कोशिकाओं के साथ बरू उदाहरण के लिए 1 एच बरू-आईपी1 (चित्रा 1C) के बाद के लिए संक्षेप में लेबल कर रहे हैं. यह छोटी लेबलिंग समय के भीतर संश्लेषित आरएनए के माप में सक्षम बनाता है और मनाया परिवर्तन आर सी-qPCR द्वारा कुल आरएनए में परिवर्तन को मापने की तुलना में आरएनए संश्लेषण में विनियमों का एक बेहतर अनुमान दे देंगे. हालांकि, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि भले ही लेबलिंग समय है, उदाहरण के लिए, केवल 1 ज, क्षरण अभी भी आरएनए स्तर पर एक प्रभाव हो सकता है मनाया ।
बरू-IP प्रयोगों से आरएनए दोनों आरटी-qPCR1 या अगली पीढ़ी अनुक्रमण2,13द्वारा बहाव विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं । अन्य मानक आरएनए खोज विधियों, जैसे कि उत्तरी सोख्ता या ribonuclease संरक्षण परख, कुछ RNAs के लिए भी लागू हो सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के साथ 1 एच के लिए नव उत्पादित आरएनए के लेबलिंग से बरू के उत्पादन के निर्धारण के लिए रू-immunoprecipitation के उपयोग का वर्णन करता है, तत्काल आरएनए निष्कर्षण और बरू-बला आरएनए के बाद । इस पद्धति का संदर्भ<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lundbeck फाउंडेशन, आर्हस विश्वविद्यालय, Dandrite और Lundbeck ए एस इस काम का समर्थन किया ।
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
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