Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van RNA-synthese. 5-Bromouridine is toegevoegd aan de cellen en opgenomen in gesynthetiseerde RNA. RNA-synthese wordt gemeten door RNA extractie onmiddellijk na de etikettering, gevolgd door 5-Bromouridine-gerichte immunoprecipitation van gelabelde RNA en analyse door omgekeerde transcriptie en kwantitatieve polymerase-kettingreactie.
Steady-state RNA niveaus zijn vergelijking tussen de twee voorwaarden, is het niet mogelijk om te onderscheiden of wijzigingen worden veroorzaakt door wijzigingen in de productie of degradatie van RNA. Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van RNA productie, met 5-Bromouridine etikettering van RNA gevolgd door immunoprecipitation, waarmee onderzoek van RNA gesynthetiseerd binnen een korte termijn (bijvoorbeeld, 1 h). Het voordeel van 5-Bromouridine-etikettering en immunoprecipitation over het gebruik van giftige transcriptionele-remmers, zoals α-amanitine en actinomycin D, is dat er geen of weinig gevolgen voor de levensvatbaarheid van de cellen tijdens kortstondig gebruik. Omdat 5-Bromouridine-immunoprecipitation alleen RNA geproduceerd binnen de korte etikettering vastlegt, langzaam geproduceerd, evenals snel gedegradeerd kan RNA echter moeilijk te meten door deze methode. De 5-Bromouridine-geëtiketteerd RNA gevangen genomen door 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan worden geanalyseerd door omgekeerde transcriptie, kwantitatieve polymerase-kettingreactie, en de volgende generatie sequencing. Alle soorten RNA kunnen worden onderzocht, en de methode is niet beperkt tot het meten van de mRNA zoals in dit voorbeeld wordt gepresenteerd.
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) maakt de studie van RNA productie in cellen met geen of zeer beperkte effecten op cel fysiologie tijdens de briefing etikettering van periode1,2. De methode berust op de opname van de afgeleide van de synthetische uridine BrU in nieuw samengestelde RNA gevolgd door IP van gelabelde RNA met anti-BrU antilichamen (Figuur 1).
Het is al bekend voor decennia die eiwitsynthese transcriptionally kan worden geregeld, en het bestaan van transcriptiefactoren was meer dan 50 jaar geleden hypothetische3. Vandaag, het is bekend dat verschillende ziekten worden veroorzaakt door disregulatie van transcriptie en RNA stabiliteit (aanvullende figuur S1 in referentie4), en de mogelijkheid voor het meten van veranderingen in RNA productie is van groot belang in het begrip ziekte ontwikkeling.
Aan de andere kant, bieden tools voor het regelen van RNA productie nieuwe mogelijkheden voor de behandeling van ziekten veroorzaakt door te weinig of te veel eiwit expressie, of ophoping van eiwitten zoals in ziekte Parkinson’s (PD). De overheersende eiwit zich ophopen als onoplosbare aggregaten in PD is α-synuclein, en het niveau van α-synuclein is direct gekoppeld aan de ziekte, zoals gene vermenigvuldiging van de α-synuclein-gen familiale PD-5 veroorzaakt. Bovendien, α-synuclein aggregaten in een concentratie afhankelijke wijze. Downregulatie van α-synuclein mRNA niveaus is dan ook een interessante therapeutische strategie, die met succes met behulp van RNA-interferentie geboekt te verlagen van neuronale cel verlies in PD knaagdier modellen6,7.
Het is belangrijk om het meten van de veranderingen in de productie van RNA veroorzaakt door ziekte of therapeutische ingrepen te kunnen. State of the art methoden voor meten steady-state niveaus van RNA, zoals omgekeerde transcriptie gevolgd door kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR), zijn niet in staat zijn onderscheid te maken tussen wijzigingen veroorzaakt door transcriptionele verordening of gewijzigd RNA stabiliteit. Een veel gebruikte methode voor het onderzoek van RNA verval tarieven is het blokkeren van de transcriptionele machine met behulp van verbindingen zoals α-amanitine of actinomycin D gevolgd door metingen van de rottende RNAs. Er zijn echter enkele problemen in verband met een totale blokkade van transcriptie in cellen, zoals inductie van apoptosis8,9. Naast de cytotoxische effecten presenteren transcriptionele remmers ook verschillende technische problemen, zoals trage cellulaire verbreiding van α-amanitine en gebrek aan specificiteit van actinomycin D (herzien in verwijzing10).
Om te voorkomen dat de totale blokkade van transcriptie, zijn nucleotide analogen gebruikt, zoals 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU) en BrU. Deze zijn gemakkelijk in beslag genomen door de cellen van zoogdieren en opgenomen in de nieuw samengestelde RNA, waardoor pulse-etikettering van RNA binnen een bepaald tijdsbestek. BrU is minder toxisch dan 5-EU- en 4-TU, waardoor het de voorkeur analogon van keuze11,12.
BrU-IP kan worden gebruikt om de onderzoeken van zowel het tarief van de RNA-synthese en stabiliteit, en dus onderscheid worden gemaakt tussen de onderliggende oorzaken van veranderingen in de totale RNA. Dit artikel zal zich richten op de meting van RNA-synthese en verwijst als u verwijst naar de2 voor meer informatie over het onderzoek van RNA stabiliteit. Om te onderzoeken RNA-synthese, worden de cellen kort geëtiketteerd met BrU bv voor 1 h gevolgd door BrU-IP-1 (Figuur 1 c). Hierdoor kunnen metingen van RNA gesynthetiseerd in de korte tijd van de etikettering en waargenomen wijzigingen zal een betere raming van de verordeningen in RNA synthese dan door het meten van veranderingen in totaal RNA door RT-qPCR. Dient te worden vermeld, echter, dat hoewel de etikettering tijd, bijvoorbeeld, slechts 1 h is, afbraak nog steeds een invloed op de waargenomen niveaus van RNA hebben kan.
RNA van BrU-IP experimenten zijn geschikt voor downstream analyse door zowel de RT-qPCR1 of de volgende generatie sequencing-2,13. Andere standaard RNA detectiemethoden, zoals het noordelijke bevlekken of ribonuclease bescherming assay, kunnen ook gelden voor bepaalde RNAs.
Dit protocol bevat een beschrijving van het gebruik van BrU-IP voor bepaling van RNA productie door etikettering van nieuw RNA voor 1 h met BrU geproduceerde, gevolgd door onmiddellijke RNA extractie en immunoprecipitation van BrU-gelabelde RNA. Deze methode is eerder beschreven in referentie16en dit artikel bevat enkele extra stappen ter verbetering van de specificiteit van de IP- en RNA zuiverheid, door vooraf behandelen kralen met lage concentraties van BrU, alsmede de zuivering van een fenol-c…
The authors have nothing to disclose.
De Stichting Lundbeck, Universiteit van Aarhus, Dandrite en Lundbeck A/S ondersteund dit werk.
Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
HEK293T cell line | ATCC | ||
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O |